Nouveaux outils de spectroscopie ultra-rapide et de simulation pour l'étude de la dynamique structurelle de complexes protéines chaperonnes/ADN – FEMTOSTACK

Voir version anglaise

Voir rapport complet

Voir version anglaise

voir liste complète dans le fichier ci-joint

Le projet FEMTOSTACK rassemble, dans une démarche inter-disciplinaire, le savoir-faire et les connaissances de la spectroscopie laser ultra-rapide, de la chimie théorique et de la biophysique moléculaire. Le but du projet est de développer de nouveaux outils expérimentaux et théoriques pour l'étude de complexes protéine/acides nucléiques, et en particulier de leur dynamique aux échelles femto- et milliseconde. L'idée de départ est d'utiliser la réduction de la fluorescence ("quenching") et les temps ultra-rapides associés comme une signature des interactions stables d'empilement, comme celles que l'on observe couramment entre des paires de résidus aromatiques, par exemple tryptophane/guanine (Trp/G). Le système modèle étudié dans la première tâche de recherche est la protéine nucléocapside du VIH et les interactions d'empilement qu’elle forme avec les séquences de liaison primaire de l'ARN viral, à savoir (+)/(-) PBS. Outre les interactions d'empilement, des motifs de liaison plus dynamique ont également été observés avec PBS.

La même approche expérimentale sera appliquée de façon à sonder la dynamique locale des bases d'ADN ou d'ARN quand elles sont marquées par une base analogue fluorescente, la 2-aminopurine (2-AP). Les propriétés de fluorescence résolues en temps de 2-AP permettent de déterminer l'hétérogénéité de façon quantitative (i.e. population de 2-AP empilées/non-empilées avec une base voisine), et comment celle-ci est affectée par la NCp7. La résolution femtoseconde combinée à un choix judicieux de séquences mutantes de PBS, apportera un nouvel éclairage sur la nature de ces interactions apparemment plus labiles. L’objectif est de caractériser l'hétérogénéité et la dynamique structurales qui empêchent la RMN de résoudre la structure de ces sites de liaison dynamique des PBS.

Utiliser la fluorescence ultra-rapide des deux sondes moléculaires que sont la Trp et la 2-AP de façon combinée permettra d'établir ces méthodes comme nouvel outil pour l'étude de la dynamique structurelle de complexes protéines/acides nucléiques.

Au titre d'un développement indépendant et dans le but d'étudier des transitions structurelles dans un complexe protéine/acide nucléique hors équilibre à l'échelle de la milliseconde, nous concevons un appareil combinant les avantages de la micro-fluidique avec les capacités de résolution picoseconde multi-canal d'une caméra "streak". Celle-ci permet d'implémenter une nouvelle forme d'imagerie par durée de vie de fluorescence (FLIM), en analysant jusqu'à 200 éléments spatiaux (voxels) en parallèle. Le long du canal micro-fluidique, chaque voxel correspond à une progression temporelle du complexe vers son état d'équilibre, et la résolution picoseconde sera utilisée pour suivre l'hétérogénéité structurelle au cours de cette évolution. Dans le contexte de la reconnaissance moléculaire, ce montage original ouvre de nouvelles perspectives pour l'observation en temps réel des changements structurels locaux induits sur un oligonucléotide par une protéine chaperonne. Nous visons donc à généraliser la technique pour l’étude des protéines CORE de l’hépatite C ou de TAT du VIH-1.

Les résultats expérimentaux seront confrontés et insérés dans un cadre théorique par des simulations de dynamique moléculaire (MD). Celle-ci a comme point de départ les structures résolues par RMN pour certains complexes NCp7/oligonucléotide modèles. La MD sera couplée aux méthodes de la fonctionnelle de densité dépendante du temps (TD-DFT) pour évaluer les temps de transfert de charge Trp/G. Dans une autre approche, des méthodes développées récemment et combinant la mécanique quantique et moléculaire (MM/PBSA) seront utilisées pour déterminer les contributions individuelles de chaque base nucléique à l'énergie de liaison de la NCp7 aux séquences de PBS.