Complexité du métabolisme phénolique chez les végétaux : exploration de nouvelles voies de biosynthèse des précurseurs de la paroi cellulaire – PHENOWALL

Les enzymes cibles ont été exprimées dans des microorganismes afin d’en préciser les fonctions spécifiques. Les profils d’expression dans la plante ont été déterminés. Le rôle de chacun dans la plante a été étudié à l’aide de mutants de sous- ou de surexpression analysés pour leur phénotype développemental et leur composition en lignine et phénols solubles. Ce travail a été permis par le récent développement de collections de mutants (IJPB, USDA).

Les résultats de PHENOWALL démontrent que les duplications de la seconde enzyme du métabolisme phénolique au cours de l’évolution ont conduit à une diversification de fonction sans modification de l’activité enzymatique principale: l’hydroxylation de l’acide cinnamique est effectuée avec des efficacités comparables par les différentes duplicats (paralogues) en dépit de différences significatives dans la structure de leurs sites actifs. La localisation subcellulaire des différents paralogues exprimés en système hétérologue (cellules épidermiques de feuille) semble être la même (les membranes du réticulum endoplasmique), bien que nos résultats indiquent des modes d’ancrage différents modifiant leur topologie membranaire. De plus, nos résultats indiquent une glycosylation potentielle de l’un des paralogues. L’analyse de leurs profils d’expression au cours du développement de la plante montre que certains d’entre eux ont des fonctions plus spécifiquement racinaires, liées à la reproduction, ou associées à certains types cellulaires. L’analyse des mutants de sous- ou de surexpression est en cours. Les résultats préliminaires disponibles jusqu’ici indiquent soit un impact modéré de la suppression individuelle ou de la surexpression de nos gènes cibles sur le développement ou la composition en lignine, soit une totale abolition de la viabilité de la plante. La production de doubles mutants est en cours pour révéler des redondances fonctionnelles. L’analyse de mutants effectuée au cours de ce travail a cependant permis de révéler la fonction d’autres gènes dans la lignification.
PHENOWALL a permis d’amorcer diverses collaborations des partenaires avec le Canada (projet Working On Wood), la Belgique, l’Allemagne et les USA.
Nouveaux projets initiés sur les bases de PHENOWALL :
- Projet METABEVO
- Projet PEACH
- Projet BRAVO.

Le projet PHENOWALL identifiera des marqueurs pour modifier la composition phénolique et la réticulation de la lignine et ainsi améliorer la production de biocarburants à partir des résidus de récolte, ainsi que la digestibilité des fourrages. Il va aussi révéler des moyens d’optimiser la composition phénolique des fleurs et des graines/fruits. Les résultats préliminaires laissent également présager un impact sur le développement de la plante, les dates de floraison, et la fertilité. Ces autres aspects permettent d’envisager diverses applications, mais restent cependant à valider.

Annotation complète des gènes de cytochromes P450 chez Brachypodium et remise en contexte : Nelson D, Werck-Reichhart D. (2011) A P450-centric view of plant evolution. Plant J. 66:194-211.

Nouvelles approches pour l’analyse des interactions protéine-protéine dans le métabolisme phénolique : Bassard JE, Richert L, Geerinck J, Renault H, Duval F, Ullmann P, Schmitt M, Meyer E, Mutterer J, Boerjan W, De Jaeger G, Mely Y, Goossens A, Werck-Reichhart D. (2012) Protein-Protein and Protein-Membrane Associations in the Lignin Pathway. Plant Cell 24:4465-4482.

Publication du TILLING des gènes P450 : Dalmais M, Antelme S, Ho-Yue-Kuang S, Wang Y, Darracq O, Bouvier d’Yvoire M, Cézard L, Légée F, Blondet E, Oria N, Troadec C, Brunaud V, Jouanin L, Höfte H, Bendahmane A, Lapierre C, Sibout R (2013). A TILLING Platform for Functional Genomics in Brachypodium distachyon. Plos One. 8: e65503.

Découverte du premier mutant chez une graminée n’ayant plus de fonction p-coumaryl monolignol transferase : Petrik DL, Karlen SD, Cass CL, Padmakshan D, Lu F, Liu S, Le Bris P, Antelme S, Santoro N, Wilkerson CG, Sibout R, Lapierre C, Ralph J, Sedbrook JC (2014). p-Coumaroyl-CoA:monolignol transferase (PMT) acts specifically in the lignin biosynthetic pathway in Brachypodium distachyon. Plant J. 77:713-26.

Le métabolisme phénolique utilise la phénylalanine pour produire les précurseurs des biopolymères pariétaux (lignine, subérine, sporopollénine, molécules de pontage) ainsi que de nombreux dérivés solubles (esters et amides phénoliques, flavonoïdes, coumarines, etc.), très abondants chez les plantes et présentant d’intéressantes propriétés anti-oxydantes ou organoleptiques. En dépit de l’importance économique de ces composés et d’une intensive ingénierie métabolique mise en œuvre pour améliorer la saccharification de la biomasse, la production du papier ou les qualités nutritives des plantes, le métabolisme phénolique et ses ramifications ne sont pas totalement élucidés. Les résultats des travaux d’ingénierie entrepris ces dernières années suggèrent en fait qu’une partie de ces ramifications sont restées ignorées. L’objectif de PHENOWALL est de révéler une partie de ces voies en s’appuyant sur une analyse fonctionnelle des paralogues de deux familles de cytochromes P450, CYP73 et CYP98, qui catalysent l’hydroxylation des cycles phénoliques en positions 3 et 4.
Les CYP73 utilisent l’acide cinnamique libre comme substrat. Des résultats récents indiquent que les CYP98 catalysent la meta-hydroxylation de plusieurs esters et amides des acides hydroxycinnamiques, avec une sélectivité très variable selon les enzymes. D’après la phylogénie, des duplications de ces familles de gènes sont intervenues très tôt dans l’évolution, avant même la divergence Monocotylédones-Dicotylédones pour CYP73. La fixation de ces duplications dans les génomes indique l’émergence de fonctions nouvelles dans le métabolisme phénolique. Nous proposons donc d’étudier les fonctions biochimiques et biologiques des paralogues de CYP73 et CYP98. Ce travail implique un criblage des activités catalytiques d’enzymes recombinantes et une étude fonctionnelle chez Brachypodium distachyon, qui s’impose actuellement comme un nouveau modèle des Graminées de grande culture telles que le blé et l’orge et des plantes ciblées pour la production d’agro-carburants de seconde génération.
Nous commencerons par identifier tous les gènes des familles CYP73 et CYP98 dans le génome de Brachypodium et préciserons leurs relations phylogénétiques. Les représentants de chaque sous-groupe seront sélectionnés et leurs spécificités catalytiques seront déterminées par expression chez la levure. Ce travail s’appuiera de la synthèse d’une librairie de substrats potentiels en complément d’une approche bio-informatique de modélisation des sites actifs et des interactions enzymes-substrats. En parallèle, les fonctions biologiques de chaque paralogue seront décrites par 1) la détermination de leurs patrons d’expression par des approches transcriptomique, PCR quantitative et constructions promoteur::GUS, 2) l’analyse phénotypique d’une série de mutants de TILLING, incluant l’analyse de leurs modifications biochimiques (polymères et composés phénoliques solubles) et développementales (fertilité, croissance).
Ce travail s’appuie sur la collaboration de 4 équipes de compétences très diverses et complémentaires, en enzymologie et génomique fonctionnelle des cytochromes P450, génétique de Brachypodium, analyse biochimique de la paroi et de la lignine, synthèse organique, bio-informatique et biochimie structurale. Il fournira une description complète de la relation philogénie/expression/structure/fonction des paralogues dans les familles d’hydroxylases CYP73 et CYP98. Il permettra ainsi de mieux appréhender la complexité du métabolisme phénolique, pour une ingénierie métabolique mieux ciblées et plus efficace visant à l’amélioration des qualités nutritives et à la production d’agro-carburants. Il permettra enfin de proposer de nouveaux précurseurs des polymères naturels ou artificiels pour des approches de biologie synthétique.