Contrôle spatial et temporel de la formation de synapses via les molécules d’adhérence neurexine/neuroligine – Synapse-2Dt

Pour contrôler temporellement la formation de synapses, nous avons déposé des agrégats de neurexine sur les neurones, et avons observé l’accumulation de marqueurs post-synaptiques, notamment la neuroligine, la protéine d’échafaudage PSD-95, et les récepteurs du glutamate de type AMPA. A l’aide de nanoparticules fluorescentes, nous avons caractérisé un mécanisme de diffusion/piégeage contrôlant l’adressage synaptique de la neuroligine et des récepteurs AMPA. Nous avons également montré que le recrutement de la PSD-95 implique une phosphorylation tyrosine de la neuroligine. Enfin, nous avons élaboré un modèle biophysique global du trafic des récepteurs AMPA aux synapses. Cette première partie du travail a ainsi permis de mieux comprendre la fonction biologique des molécules d’adhérence neurexine et neuroligine dans l’assemblage synaptique.

• Les récepteurs AMPA sont recrutés rapidement par les adhésions neurexine/neuroligine, suggèrant un rôle de ces récepteurs dans l’initiation des synapses.
• Nous avons construit un modèle unifié du trafic des récepteurs AMPA aux synapses, permettant une meilleure compréhension des processus de plasticité synaptique.
• La liaison de la neurexine induit la phosphorylation tyrosine de la neuroligine, un mécanisme qui joue un rôle dans l’assemblage de synapses excitatrices versus inhibitrices. Ce mécanisme ouvre des pistes pour l’identification d’une tyrosine kinase importante dans le contrôle de l’équilibre excitation/inhibition, un paramètre majeur dans les pathologies neurologiques.
• Nous avons mis au point des substrats micropatternés recouverts de neurexine ou SynCAM pour contrôler spatialement la formation de pré- ou post-synapses, qui ouvrent des perspectives de criblage haut-débit de composés impliqués dans la différentiation synaptique.
• Nous avons mis au point une plateforme d’acquisition automatisée permettant de réaliser du sptPALM, combinant microscopie de super résolution par photo-activation et suivi de protéines individuelles à haut-débit.
• Nous avons développé plusieurs solutions logicielles pour la quantification de l’organisation et de la dynamique moléculaire à partir de données de microscopie de super-résolution par localisation de molécules individuelles.

Pour contrôler spatialement la formation de synapses, nous avons développé un système biomimétique de la synaptogénèse en cultivant des neurones sur des substrats micro-patternés, formés d’îlots recouverts de SynCAM ou neurexine. Ce système permet d’induire respectivement des pré- ou post-synapses à de multiples endroits parfaitement localisés, offrant ainsi des perspectives de criblage.
Ces nouveaux systèmes pourront servir de base pour un criblage haut débit de composés pharmacologiques, peptides, ou siRNA susceptibles de modifier les étapes initiales de la formation synaptique. Sachant que des mutations de la neurexine et la neuroligine ont été impliquées dans l’autisme, le retard mental, et la schizophrénie, ces travaux pourraient permettre à terme l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour ces pathologies neuro-développementales.

• Recrutement des récepteurs AMPA aux adhésions neurexine-neuroligine, via diffusion membranaire et piégeage (Mondin et al. Journal of Neuroscience, 2011).
• Modèle unifié du trafic synaptique des récepteurs AMPA (Czöndör et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012).
• La phosphorylation tyrosine de la neuroligine contrôle de façon préférentielle l’assemblage de synapses excitatrices versus inhibitrices (Giannone et al. Cell Reports 2013).
• Nouveaux substrats micropatternés pour le contrôle de la différentiation synaptique (Czondör et al. Nat. Comm. 2013 et Dépôt de brevet PCT 2012).
• Méthode d’analyse pour la localisation de molécules individuelles par les ondelettes : Brevet Sibarita JB. (CNRS / Univ. Bordeaux Segalen), N°12166450.2, Europe/US, 2012. Articles : Izeddin et al, Optics Express 2012. Kechkar et al., Plos One 2013)

Contexte scientifique
Une problématique fondamentale de neurobiologie est celle de l'assemblage et de la spécificité des contacts entre cellules nerveuses, les « synapses ». Toutefois, la formation spontanée de synapses est imprévisible et donc difficile à observer en temps réel, résultant en un petit nombre d'études sur ces processus, avec une résolution temporelle relativement faible. D’où l’utilité de mettre en place de nouveaux systèmes permettant l'induction robuste, sélective et ciblée de la formation des synapses, associée à une production de statistiques importantes et reproductibles. Par ailleurs, des études récentes (incluant nos propres travaux) ont montré que le complexe d’adhérence neurexine/neuroligine jouait un rôle fondamental dans l’initiation des synapses.
Objectifs
Nous mettrons l'accent sur la conception de nouvelles méthodes pour sonder la formation des synapses, en nous basant sur les propriétés synaptogènes des complexes d'adhérence neurexine/neuroligine.

Le projet comporte trois partenaires:
1) O. Thoumine, un spécialiste de neurobiologie et de l'adhérence cellulaire
2) CYTOO SA, une start-up spécialisée dans le développement et la production de substrats micro-structurés
3) JB. Sibarita, un spécialiste en microscopie optique et imagerie quantitative

Nous établirons trois tâches principales:

Etape 1. Le développement de nouveaux substrats micro-structurés pour la croissance neuronale et la synaptogenèse (CYTOO / Thoumine).

Nous allons développer un système biomimétique de la synaptogénèse en cultivant des neurones sur des substrats formés de réseaux réguliers d’îlots recouverts de neurexine ou neuroligine purifiées. Cytoo SA est une start-up localisée à Grenoble qui développe, fabrique et commercialise des substrats micro-structurés « haute technologie » pour la culture cellulaire, avec des applications à la fois académiques et industrielles. L’accent est mis sur les tests cellulaires et l'analyse à haut débit. Ce type de technologie n'est pas utilisé actuellement dans le domaine de la synaptogenèse. L'objectif est d'obtenir un brevet et un produit fabriqué, qui sera mis à la disposition de la communauté toute entière en neurobiologie cellulaire.

Etape 2. Le développement de nouvelles méthodes d'imagerie quantitative pour le criblage à haut débit de la synaptogenèse (Sibarita / Thoumine).

En collaboration avec JB Sibarita, un expert des interfaces en microscopie optique et de l’analyse d’image, nous proposons de coupler ce système de culture sur substrats micro-structurés à un vidéo-microscope automatisé multimode combinant multi-couleur, TIRF, champ large et photo-perturbation locale. Ceci nous permettra une lecture point par point de différents marqueurs pré- et post-synaptiques, avec d'excellentes résolutions spatiales et temporelles, et donc une énorme statistique sur la différenciation synaptique médiée par le complexe neurexine / neuroligine. Ceci permettra un criblage de réactifs susceptibles de modifier ou de promouvoir les étapes précoces de la synaptogenèse, et déboucher à terme sur l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter des maladies du cerveau associées à des mutations génétiques de la neuroligine (autisme et retard mental).

Etape 3. L’étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement des synapses via le complexe neurexine /neuroligine (Thoumine).

Nous réaliserons également un ensemble de mesures fonctionnelles sur ces hémi-synapses, en utilisant ces nouveaux substrats micro-structurés ainsi que d’autres systèmes biomimétiques déjà développés (microsphères, Quantum dots, protéines d’adhérence réticulées par anticorps), ainsi que des techniques d’imagerie de fluorescence (notamment décageage de glutamate et enregistrement de signaux calciques). Nous espérons ainsi identifier la chronologie précise des événements qui mènent de la reconnaissance adhésive initiale à l’assemblage d’une synapse fonctionnelle.