Synthèse et signalisation de l’acide abscissique dans les graines d’Arabidopsis – ABSIG

Le réseau de signalisation de l’ABA est étudié en utilisant des approches 'omiques' chez des mutants déficients en ABA, dont les graines sont récoltées à différents stades de développement, avant et après l'induction de la dormance. L’analyse du transcriptome est réalisée à l'URGV-Evry par hybridation à des puces CATMAV6. Le protéome soluble total est analysé par électrophorèse bidimensionnelle et les protéines différentiellement exprimées sont identifiées par spectrométrie de masse. Enfin l’analyse du métabolome par spectrométrie de masse permet de déterminer la teneur en ABA et ses catabolites, ainsi que celle des métabolites majeurs accumulés dans la graine. Les gènes et protéines différentiellement exprimés seront étudiés plus avant.
La recherche de régulateurs de la synthèse d’ABA est réalisée par deux types d’approches. La première consiste à rechercher des mutations qui dérégulent l’expression d’un gène de biosynthèse de l’ABA. La sélection des mutants est visuelle par détection de l’expression d’un gène rapporteur placé en aval du promoteur du gène étudié. Les gènes mutés sont identifiés par séquençage profond. L’autre approche, dite simple-hybride, consiste à tester dans la levure l’interaction, avec une séquence promotrice, d’un grand nombre de facteurs de transcription d’Arabidopsis, puis à les valider par analyse fonctionnelle.
Les gènes candidats issus d’expériences de mutagenèse, simple hybride ou ‘omiques’ sont étudiés par des analyses génétiques, physiologiques, moléculaires et biochimiques, en utilisant les mutants d’insertion disponibles dans les banques de graines. Il s’agit notamment d’étudier la germination, l’accumulation d’hormone, l’expression de gènes ou l’activité de protéines.

Après mutagenèse de graines, nous avons sélectionné une trentaine de mutants potentiellement dérégulés pour l’expression d’un gène de biosynthèse de l’ABA, appelé NCED6. Nous avons également identifié une famille de facteurs de transcription capables d’interagir avec le promoteur du gène NCED9. Les mutants et gènes candidats sont en cours d’étude.

L’identification de gènes impliqués dans le contrôle de la dormance présente un intérêt potentiel pour l’amélioration des espèces cultivées. En effet, chez le blé par exemple, la germination sur pied avant récolte des grains résulte d’une dormance trop faible. Elle se produit sous certaines conditions climatiques et induit de fortes pertes économiques du fait de la mauvaise qualité des grains. A l’opposé certaines espèces présentent une dormance trop forte, qui nuit à l’homogénéité de la germination au champ.

Une publication dans Plant Journal décrit la spécificité tissulaire d’expression d’une famille de gènes de biosynthèse de l’ABA, dans la graine d’Arabidopsis, et leur contribution à l’induction de la dormance.
Frey A, Effroy D, Lefebvre V, Seo M, Perreau F, Berger A, Sechet J, To A, North HM, Marion-Poll A (2012) Epoxycarotenoid cleavage by NCED5 fine-tunes ABA accumulation and affects seed dormancy and drought tolerance with other NCED family members. Plant J 70, 501-512

Dans les graines, l’ABA est synthétisé dans des tissus de différente origine, le tégument est constitué de tissus maternels dérivant des téguments de l’ovule, tandis que l’albumen triploïde et l’embryon diploïde sont issus de la double fécondation. De plus, une importante fraction de l’ABA est transportée de la plante-mère vers la graine. L’accumulation d’ABA d’origine maternelle est maximale pendant la phase de maturation et stimule l’accumulation des réserves, tandis que l’ABA des tissus embryonnaires est accumulé plus tardivement and induit la dormance et la tolérance à la dessiccation.
Nos études antérieures de l’expression des gènes NCED (9-cis époxy-carotenoid dioxygénase), codant des enzymes clés de la voie de biosynthèse de l’ABA, ont montré que leur expression, à la fois dans l’embryon et l’albumen, contribuait à l’induction de la dormance. Nous avons donc pour objectif dans ce projet de comprendre comment les différents pools d’ABA sont régulés dans les graines, et si les réseaux de signalisation diffèrent selon la source d’ABA. Pour cela, des approches ‘omiques’ et génétiques (directe et inverse) seront mises en œuvre pour identifier les gènes de la voie de signalisation intervenant dans les graines, et quelles sont leurs cibles. Nous tirerons parti d’un matériel génétique original qui a été spécialement obtenu dans notre groupe, dans lequel l’expression de gènes de synthèse d’ABA est spécifiquement limitée à certains tissus (maternel/embryon/albumen). Ces mutants sont dépourvus des phénotypes pléiotropes affectant notamment l’appareil végétatif, qui sont caractéristiques des mutants de déficience en ABA ou de sensibilité à l’hormone, le plus souvent étudiés auparavant. Nous avons l’intention de déterminer quels éléments de signalisation connus sont différentiellement régulés par l’ABA de certains tissus et d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’induction de la dormance par l’ABA.
La régulation précise du niveau d’hormone est cruciale pour le contrôle des réponses physiologiques. Néanmoins aucun gène régulant de façon directe des gènes de synthèse d’ABA n’a encore été mis en évidence. Compte tenu de l’importance des gènes NCED dans la régulation de la voie, notre deuxième objectif sera d’identifier des facteurs de régulation de ces gènes. Nous avons produit des plantes transgéniques comportant à la fois les construits pNCED6::GUS and pNCED6::GFP qui seront utilisées pour identifier des mutants dont l’expression du gène NCED6 est altérée; elle est, chez le type sauvage, spécifique de l’albumen. De plus, en collaboration avec notre partenaire japonais, le même matériel sera utilisé pour le recherche de mutants par ‘chemical genetics’. Des séries de délétions des promoteurs NCED ont aussi été réalisées et seront utilisées pour identifier des facteurs de transcription qui interagissent avec ces promoteurs.
De nombreux loci ont été identifiés et leur implication démontrée dans la signalisation de l’ABA pour contrôler le fonctionnement des stomates ou les réponses au stress. Toutefois l’intégration de beaucoup de ces gènes dans un réseau global n’est pas encore possible. Le puzzle est encore incomplet, comme l’illustre la découverte récente qu’une famille de protéines START est responsable de la perception de l’ABA. Le réseau de signalisation de l’ABA dans les graines est encore moins bien établi, car la graine est un modèle d’étude moins facile que le stomate. Nous avons isolé, dans des travaux antérieurs, deux mutants potentiellement nouveaux présentant des phénotypes liés à la régulation de la germination par l’ABA. Nous proposons dons dans une troisième partie d’identifier les loci mutants et de caractériser les gènes correspondants, ajoutant ainsi deux nouveaux gènes au réseau de signalisation de l’ABA pour le contrôle de la dormance et la germination. Nous étudierons leur possible relation avec les gènes candidats identifiés dans les deux premiers volets du projet.