Blanc SIMI 7 - Sciences de l'information, de la matière et de l'ingénierie : Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique

Nouveaux fluorophores pour les Sciences de la Vie – PROFLUO

Synthèse de nouveaux marqueurs fluorescents de protéines plus sensibles et plus sélectifs

Dans un échantillon biologique complexe, il est important de pouvoir visualiser et quantifier les protéines présentes (des plus présentes aux moins abondantes) car certaines familles de protéines, peuvent être impliquées dans différents processus (maladies, résistance aux antibiotiques…) même à très faibles concentrations.

Trouver l’aiguille (protéine) dans la botte de foin (protéome)

La protéomique consiste en l’étude et l’identification précise des protéines (protéome) présentes dans un environnement biologique (organisme, organe, tissu, cellule…) est un enjeu majeur actuel. En effet, la composition en protéine (protéome) peut varier en fonction du temps et de l’environnement, de l’état physiologique de l’organisme étudié… Les protéines sont donc, non seulement d’excellents indicateurs de cet état (outils de diagnostic), mais elles peuvent être aussi responsables de diverses pathologies ou être indispensables à la survie d’une espèce. Le programme de recherche sera axé sur le développement de nouveaux marqueurs de protéines, basés sur une structure de produit naturel, plus sensibles et plus sélectifs de protéines d’intérêt. A titre d’exemple, la recherche de protéines spécifiquement exprimées par des bactéries impliquées dans la formation de biofilms responsables, entre autres, de maladies nosocomiales particulièrement difficiles à traiter, s’inscrit résolument dans un cadre de santé publique. Pour cela, les marqueurs fluorescents, non toxiques et ciblant spécifiquement des protéines d’intérêt est une stratégie d’avenir qui permet notamment de contourner les approches de modifications génétiques.

Le développement de nouveaux outils biologiques permettant de visualiser des protéines en les rendant fluorescentes, axe de recherches des Sciences de la Vie en plein essor, nécessite des outils toujours plus efficaces et sensibles. Il faut d’une part synthétiser l’outil (marqueur) puis valider son efficacité à capturer une protéine particulière. L’outil sera élaboré à partir du squelette d’un produit naturel isolé d’un champignon.
2 approches complémentaires ont été menées.
1) extraction de protéines à partir d’organes, tissus, biofilms, cellules, puis recherche de la protéine ou de la famille de protéines par des approches de protéomique
2) suivi/localisation d’une protéine au sein de cellule ou biofilm par des approches de microscopie de fluorescence.
D’autre part, pour guider le chimiste dans le choix des structures à synthétiser, des calculs de chimie théorique (sur ordinateur) permettront de prédire et d’optimiser les propriétés de fluorescence de ces marqueurs.
Pour mener à bien ce projet transdisciplinaire, un consortium de chimistes théoriciens et organiciens ainsi que des biologistes et photophysiciens met en commun leur domaine d’expertise respectif, de façon à perfectionner ces outils.

Les premières sondes fonctionnelles ont été préparées après amélioration de la voie de synthèse rendue plus courte et plus efficace. Les protéines de surface de Pseudomonas aeruginosa (responsable de maladies nosocomiales) ont été capturées spécifiquement et identifiées ; les bactéries ont pu être visualisées grâce aux propriétés de fluorescence des sondes. L'imagerie cellulaire semble montrer un marquage préférentiel des environnements lipophiles, dépendant de la structure des sondes. Les calculs théoriques ont permis d'établir un modèle mathématique permettant de prévoir les caractéristiques physicochimiques de nouveaux fluorophores.

Les perspectives attendues pour ce projet sont doubles.
Tout d’abord, l’obtention de nouveaux marqueurs très sensibles des protéines se situe dans un domaine très compétitif qui peut trouver des applications directes (différentes sociétés distribuant déjà ce type de marqueurs ont manifesté leur intérêt).
D’autre part, la maîtrise de la synthèse de ces marqueurs permet maintenant de les rendre multifonctionnels et d’envisager de nouvelles applications. En effet des protéines très spécifiques et présentes en très faibles quantités vont être ciblées afin de les identifier et de comprendre leur rôle dans les domaines des sciences de la vie et de la santé.
Ce projet permettra ainsi la détection et le suivi d’une protéine, biomarqueur d’une pathologie, par des approches complémentaire de protéomique et d’imagerie cellulaire.

Les publications suivantes résultent des calculs théoriques effectués pour une meilleure compréhension des phénomènes de fluorescence :
- Electronic Excitations in Epicocconone Analogues: TDDFT Methodological Assessment Guided by Experiment
Ol

La découverte d'un nouveau composé fluorescent (epicocconone) isolé en 2003 d'un champignon Epicoccum nigrum est à la base de ce programme de recherches. Cette molécule a la particularité de se lier aux protéines (via l'amine de la lysine) de façon covalente et de former une énamine qui est hautement fluorescente (émission à 610 nm, absorption à 395 ou 520 nm). Il s'agit d'un profluorophore original qui permet de quantifier des protéines avec ne sensibilité encore inégalée. Qui plus est, en fonction des conditions expérimentales, l'accrochage covalent avec les fonctions amine s'avère réversible, ce qui permet ensuite de déterminer la structure des protéines par spectrométrie de masse. Nous venons de mettre au point la première synthèse d'analogues de cette molécule, qui ont montré des propriétés de fluorescence très proches du produit naturel, avec même des intensités de fluorescence supérieures. Nous voulons maintenant étendre le spectre d'application de ces analogues au ciblage et à l'identification de protéines dans un environnement complexe, au marquage de cellules et de compartiments cellulaires particuliers (imagerie cellulaire). Ceci passera par la modification structurale du squelette de base de la molécule de façon à introduire les groupements fonctionnels requis pour l'adressage de ces fluorophores. Nous envisageons de préparer des molécules pouvant se comporter comme profluorophore (devenant fluorescent en se liant aux protéines) ou comme fluorophores (nativement fluorescent). D'un point de vue plus fondamental, le mécanisme de fluorescence sera étudié et des calculs DFT permettront de rationaliser la synthèse de nouveaux fluorophores originaux. Ainsi, ce projet réunit différents partenaires qui évolueront à l'interface chimie-biologie: UMR6014, UMR6270, IFRMP23 tous situés sur le campus de l'Université de Rouen.

Coordinateur du projet

UNIVERSITE DE ROUEN [HAUTE-NORMANDIE] (Laboratoire public)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UNIVERSITE DE ROUEN [HAUTE-NORMANDIE]
UNIVERSITE DE ROUEN [HAUTE-NORMANDIE]
UNIVERSITE DE ROUEN [HAUTE-NORMANDIE]
UNIVERSITE DE ROUEN [HAUTE-NORMANDIE]

Aide de l'ANR 370 000 euros
Début et durée du projet scientifique : - 36 Mois

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