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Rôle et régulation de l'activité des caspases au cours de l'érythropoïèse normale et pathologique – CASER

Résumé de soumission

Contexte scientifique et objectifs Deux phases successives peuvent être distinguées au cours de la différenciation érythroïde: une phase de prolifération intense accompagnée d'une lente maturation des progéniteurs et une phase de différenciation où les cellules se transforment en globules rouges avec une prolifération limitée. Nous avons montré que la réalisation du programme de différenciation nécessite une activation transitoire des caspases n'entrainant pas d'apoptose. Certains substrats des caspases comme le facteur de transcription GATA-1 clivé au cours de l'apoptose sont protégés au cours de la différenciation. Le but de ce travail est de comprendre comment sont activées les caspases au cours de la différenciation érythroïde et quel est le rôle exact de cette activation. Pour cela il est nécessaire d'identifier les protéines clivées au cours de ce processus et de déterminer l'importance de leur clivage. Nous rechercherons aussi les cibles des caspases au cours de l'apoptose et nous déterminerons comment certaines de ces protéines sont protégées lors de la différenciation. Nous avons récemment montré que la protection de GATA-1 était due à son association avec la protéine HSP70. Cette association est elle-même régulée par l'Epo qui contrôle la localisation nucléaire d'HSP70. Nous déterminerons 1- comment l'Epo contrôle l'association d'HSP70 avec GATA-1, 2- si d'autres substrats différentiellement clivés au cours de la différenciation et de l'apoptose sont aussi protégés par ce mécanisme. Enfin, nous rechercherons si ce système mettant en jeu des protéines de choc thermique est modifié dans deux pathologies humaines : les syndromes myélodysplasiques (SMD) et la polyglobulie de Vaquez (PV). Description du projet Nous utiliserons la lignée I-11 et des populations de progéniteurs érythroïdes (PE) établies à partir de cellules ES pour identifier les protéines clivées par les caspases. Dans les deux cas, il est possible d'amplifier considérablement les cellules au stade proérythroblaste et d'induire une différenciation synchrone en modifiant le cocktail de cytokines. Des clones stables de ces cellules exprimant la protéine inhibitrice des caspases p35 seront établis. Les cellules seront induites à se différencier ou à entrer en apoptose par privation en cytokines. Les protéines clivées par les caspases dans les deux cas seront identifiées par électrophorèse 2D réalisées à partir de lysats cellulaires totaux ou d'extraits nucléaires. Une analyse « gel free » sera aussi réalisée en utilisant la technique COFRADIC pour pallier aux limitations bien connues de la méthode E2D. L'importance du clivage des protéines identifiées sera analysée dans des systèmes de culture de PE humains en surexprimant les fragments de ces protéines, des formes non clivables ou en utilisant des siRNA. D'autre part, des cultures de PE seront dérivées de cellules ES génétiquement modifiées lorsque des modèles murins pertinents seront disponibles. Plusieurs données suggèrent que la voie intrinsèque de l'apoptose est responsable de l'activation des caspases lors de la différenciation. Nous rechercherons si des modifications d'expression des protéines pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 contribuent à cette activation. D'autre part, il semble que la diminution de l'intensité de la signalisation intracellulaire due d'une part à la disparition des récepteurs du SCF et aux mécanismes puissants de down-régulation de l'EpoR contribue à l'activation des caspases. Nous testerons cette hypothèse en utilisant des récepteurs Epo délétés des motifs nécessaires à l'arrêt du signal. Nous identifierons les relais de signalisation qui contrôlent la localisation nucléaire d'HSP70 en utilisant d'une part des inhibiteurs chimiques et d'autre part des mutants de l'EpoR incapables d'activer certaines voies de signalisation intracellulaire. Ces données seront confirmées par la surexpression ou l'inactivation par siRNA de protéines clés de ces relais. GATA-1 subit différentes modifications post-traductionnelles (acétylations, sumoylations, phosphorylations) dont certaines sont régulées par la signalisation Epo. Nous rechercherons en utilisant différents mutants de GATA-1 s'il existe une relation entre ces modifications et l'interaction de GATA-1 avec les HSP. Les anémies des SMD de bas grade sont principalement dues à une apoptose intense et une différenciation anormale des PE. Une analyse préliminaire du transcriptome des PE de SMD montre que l'expression des protéines HSP semble perturbée. Nous vérifierons ce résultat au niveau protéique et nous rechercherons si, comme dans les PE normaux, HSP70 protège GATA-1 du clivage par les caspases dans les PE de SMD. D'autre part, nous avons observé que HSP70 est constamment présent dans le noyau des PE de patients présentant une PV, que ces cellules possèdent un allèle muté de Jak2 ou non. Nous rechercherons les mécanismes responsables de la localisation nucléaire d'HSP70 dans cette pathologie.

Coordination du projet

Olivier Hermine (CNRS DELEGATION REGIONALE PARIS A)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS DELEGATION REGIONALE PARIS A

Aide de l'ANR 550 000 euros
Début et durée du projet scientifique : - 36 Mois

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