– Heme c'

L'hème (Fe-protoporphyrine IX) est un cofacteur essentiel pour plusieurs processus biologiques fondamentaux. C'est un macrocycle hydrophobe et cytotoxique qui requiert des systèmes spécifiques pour le convoyer en sécurité à ses destinations subcellulaires. Les complexes cytochrome bc sont parmi les plus importantes hémo-protéines, ils associent des hèmes c, des hèmes b et des centres fer-soufre. Ils sont ubiquitaires dans les membranes transductrices d'énergie où ils transfèrent des électrons d'un transporteur lipo-soluble à un transporteur hydro-soluble tout en construisant un gradient transmembranaire de protons. La photosynthèse oxygénique, source de la vie terrestre, est le système bioénergétique le plus important qui équilibre l'atmosphère sur terre et permet la fixation du carbone. Un enzyme critique dans ce processus, le complexe cytochrome b6f diffère des autres membres de cette famille par un cofacteur atypique, l'hème ci' fixé sur une de ses sous-unités protéiques le cytochrome b6. - Pour progresser dans notre compréhension de l'hème ci', nous proposons d'utiliser l'algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii comme système modèle car elle est fort adaptée aux études génétiques, spectroscopiques et biochimiques. Nous avons déjà isolé plusieurs mutants d'hème ci'. Les mutants nucléaires empêchant la fixation de l'hème ci' et les mutants chloroplastiques dépourvus du résidu cystéine impliqué dans la fixation covalente de l'hème ci' accumulent très peu des sous-unités du complexe b6f et ne sont pas phototrophes. Sur la base de ces mutants, nous avons caractérisé quatre protéines CCB en tant que protéines membranaires intégrales requises pour la liaison covalente de l'hème ci' au cytochrome b6 (Kuras et al., soumis). Aucune de ces protéines n'avait avant de fonction connue. Elles définissent une nouvelle voie métabolique (système IV), complètement distincte de celles impliquées préalablement dans la biogenèse des cytochromes dans les deux dernières décades. Elles sont codées par les génomes de tous les organismes à photosynthèse oxygénique. Ces protéines sont donc parmi les rares qui distinguent les cellules photosynthétiques dégageant de l'oxygène des autres types de cellules vivantes. Les interactions et fonctions spécifiques de ces quatre facteurs seront caractérisées par des moyens biochimiques et par hybridation dans différents systèmes d'expression hétérologue. Le rôle de résidus et de domaines sera testé par mutagenèse dirigée. De nouveaux facteurs de biogenèse seront recherchés directement par mutagenèse aléatoire et indirectement par la recherche de suppresseurs extragéniques de mutants ccb. - Nous ferons l'analyse génétique et phénotypique des suppresseurs phototrophes des mutants ccb afin d'atteindre une compréhension profonde de la biogenèse et de la fonction de l'hème ci'. Dans des études préliminaires nous avons obtenus un révertant intrigant qui accumule in vivo du complexe b6f semblant dépourvu d'hème ci' et qui devrait offrir une possibilité unique de tester le rôle exact de cet hème. Nous étudierons les propriétés de transfert linéaire et cyclique d'électrons, de signalisation redox et de transitions d'état d'abord dans ce mutant puis dans d'autres suppresseurs générés au court du projet. Nous supposons que la paire hème ci'/ hème bh fournit les deux électrons requis pour réduire la plastoquinone en plastoquinole, expliquant l'apparente absence de semiquinone dans le site Qi dans le complexe b6f sauvage à la différence de ce qui est observé dans les complexes bc bactériens à photosynthèse anoxygénique. Nous avons en effet observé que ce révertant est très photosensible en forte lumière et seulement en présence d'oxygène. Nous désirons mieux comprendre les mécanismes de production d'espèces d'oxygène réactif dans ce révertant et comment les inhibiteurs de site de fixation de quinone affectent cette propriété. Sa photosensibilité sera utilisée dans un plan de sélection pour cloner le gene(s) re