– SIPHO-PHAGES

Arrière plan scientifique - La fonction des virus est de protéger leur génome et de le transmettre efficacement dans la cellule cible. Plus de 95% des virus bactériens (bactériophages ou phages) ont un génome à ADN double-brin et une queue attachée au vertex de la protéine portail. Leur queue reconnait spécifiquement la bactérie hôte et perce sa paroi, permettant un transfert du génome dans le cytoplasme. La plupart de ces phages ont une longue queue (~150 nm) non contractile (Siphoviridae). Elle est composée d'un module dédié à l'adhésion, connecté à la capside par un large tube hélicoïdal. L'adsorption irréversible du phage à la surface bactérienne génère un signal le long de la queue qui permet l'expulsion de l'ADN. - La première étape de l'infection d'une bactérie Gram+ par les Siphoviridae implique des interactions entre la protéine liant le récepteur (RBP) et un récepteur spécifique à la surface cellulaire. La RBP est située au bout de la queue du phage, dans une structure pouvant être minimale, l'embout (phage SPP1), ou plus complexe, la plaque basale (phages tuc2009 ou p2). Nos structures cristallines de 3 RBPs de phages infectant Lactococcus lactis ont révélé leur modularité et la nature saccharidique de leur récepteur. Nous avons aussi identifié le récepteur protéique irréversible du phage SPP1 infectant Bacillus subtilis, dont l'ectodomaine déclenche l'expulsion de l'ADN viral in vitro. - Ces réalisations ont promu l'étude synergique des phages SPP1, tuc2009 et p2 afin de caractériser la structure des queues de Siphoviridae et la fonction de leurs composants au cours de l'infection. Cette vue d'ensemble moléculaire de la queue non contractile des phages n'est pas documentée, en dépit leur l'abondance et de l'impact économique de l'infaction des bactéries Gram+. L'infection phagique de L.lactis est un problème économique majeur qui perturbe la fabrication de produits laitiers fermentés, un problème récurrent dans l'industrie laitière. - - Objectifs - Un seul phage ne suffit pas pour représenter tous les Siphoviridae. Nous avons donc choisi trois phages (SPP1, tuc2009 et p2) avec des embouts/plaques basales suffisamment diverses pour échantillonner la famille. Notre objectif est d'analyser la structure et la fonction de leur queue et d' obtenir (i) les structures 3D individuelles des composants des embouts/ plaques-basales, (ii) la structure de complexes entre ces composants et (iii) les reconstructions de sous-structures de la queue par cryoEM. Les données structurales vont encadrer et guider des études en vue de caractériser (iv) le réseau d'interactions protéiques nécessaires à l'assemblage de la queue, et (v) les réarrangements moléculaires de l'appareil d'adsorption et de la queue déclenchés par l'interaction avec le récepteur saccharidique ou protéique, et dont le signal aboutit à l'expulsion du génome de la capside virale. - - Méthodologie - La plateforme de Génomique Structurale de l'AFMB a permis l'expression soluble des protéines structurales de tuc2009; celles de SPP1 (VMS et AFMB) et p2 sont en cours d'expression. Ces protéines seront soumises à des essais de cristallisation avec la technologie nano-gouttes développée à l'AFMB. Les interactions entre les protéines structurales seront détectées et analysées par co-purification de complexes doublement étiquetés (His6/Strep) par réfractometrie et DLS en ligne. Elles seront aussi étudiées par génétique, hydrodynamique et Biacore, et la topologie de la queue sera établie par immuno-microscopie électronique. Les structures 3D des protéines individuelles et des oligo-complexes seront déterminées par diffraction aux rayons X et celles des complexes plus gros ou des chimères virales seront obtenues par cryoEM. Les structures cristallines seront ajustées dans les cartes de densité électronique de la cryoEM; ceci fournira des meta-structures à pseudo haute résolution. Les différences entre les structures apo- et des complexes avec le récepteur fourniront d