Rôle de TFiH dans la régulation de l'expression des gènes par divers récepte nucléaires – iHREGULATOR

1- contexte scientifique et objectifs du projet TFIIH est un complexe impliqué dans divers processus cellulaires, telles que la transcription ou la réparation de l'ADN. Des mutations au sein de ses deux plus grandes sous-unités (les helicases XPD et XPB) sont associées à des maladies autosomales récessives rares, telles que le Xeroderma Pigmentosum (XP) et la Trichothiodystrophie (TTD). Ces maladies furent définies comme associées à des défauts de réparation de l'ADN. Cependant, ces patients présentent un tableau clinique complexe (retard mental, lipodystrophie, cancers cutanés,…), complexité suggérant des défauts dans la médiation de l'effet des hormones au niveau transriptionnel. En ce sens, un défaut de transactivation médié par certains récepteurs nucléaires (RN) (comme le récepteur de la vitamine D (VDR), les récepteurs activés par les proliférateurs de péroxisomes (PPAR) ou les récepteurs aux hormones thyroïdiennes (TR) fut obervé dans des cellules issues de patients présentant diverses mutations du gène xpd. Ce défaut de transactivation est de plus associé à une diminution de la capacité de TFIIH à phosphoryler ces récepteurs via sa kinase cdk7. Or, le rôle de cette phosphorylation est à ce jour inconnu. Notre projet a donc pour objectifs: - d'élucider le rôle de la phosphorylation des RN par cdk7. - d'analyser dans un contexte physiologique les conséquences d'un défaut de transactivation par les RN at par extension de nombreux activateurs.

2- description du projet, méthodologie Nous nous focaliserons sur le lien entre TFIIH et TR, PPARs ou VDR, récepteurs connus pour être impliqués dans des processus affectés chez les patients XP et TTD (l'homéostasie énergétique, le developpement du cerveau et du squelette,…) Ces récepteurs seront utilisés comme modèles afin d'étudier si leur phosphorylation (ou celle de leur partenaire) par cdk7 favorise le recrutement et/ou la dissociation d'autres facteurs de transcription sur les promoteurs correspondants. Des formes mutantes non phosphorylables ou constitutivement phosphorylées de ces récepteurs seront utilisés dans des techniques d'immunoprecitpitation (IP), les facteurs immunoprécipités et leurs protéines associées, étant analysés notamment par spectrométrie de masse. Par ailleurs, des lignées stables surexprimant les récepteurs mutés seront générées afin d'étudier par RT-PCR quantitative l'expression de gènes cibles pour chaque récepteur. Le recrutement et/ou la dissociation d'autres facteurs (co-adaptateurs, TFIIH,…) seront analysés en employant diverses approches (ChIP assays, IP, microscopie confocale). Enfin, nous développerons un système de transcription in vitro reconstitué sur ADN chromatinisé, afin d'exactement cerner la mécanistique engageant la phosphorylation des RN. De plus, des souris TTD seront utilisées pour analyser in vivo l'incidence du défaut de transactivation par les RN, tel que TR dans le cerveau. Il sera tout d'abord nécessaire d'étudier l'évolution de traits phénotypiques chez ces animaux (lipodystrophie, microcephalie,…). Nous développerons (en collaboration avec l'IRCAD) un examen tomodensitométrique 3D de ces souris. Cette approche innovante permettra des examens itératifs sur le même animal. En parallèle, des biopsies après reconstruction 3D dans des tissus d'intérêt (foie, tissus adipeux,…) seront réalisées pour des analyses plus fines (RT-PCR quantitative, ChIP, Western Blot,…). Enfin, l'action de TFIIH sur l'activité des RN sera analysée in vivo dans des souris invalidées pour TFIIH après infection avec le virus RVFV. Connu pour essentiellement infecter le foie et le cerveau, ce bunyavirus déstabilise le complexe TFIIH via sa protéine NSs. Une analyse histopathologique, une étude portant sur l'expression ainsi que sur le recrutement de facteurs de transcription sur plusieurs gènes cibles seront ainsi entreprises dans ces mêmes tissus.

3- résultats attendus Ce projet permettra de mieux comprendre le mode d'action des RN et de leurs cofacteurs. Nous serons à même de savoir: - si et comment TFIIH influe sur l'activité des RN selon un mécanisme commun, à savoir par l'intermédiaire de son activité kinase. - si l'action de TFIIH sur la transactivation médiée par les RN se produit seulement pendant des étapes spécifiques du développement et/ou de façon tissu-spécifique. - comment la phosphorylation affecte de manière sélective l'activité d'un récepteur en fonction de son gène cible. In fine, nous pourrons établir un lien entre défaut de transcription et l'émergence de certains traits phénotypiques observés chez les patients, comme la lipodystrophie et les troubles nerveux. Comprendre comment ces facteurs agissent revêt un intérêt majeur, notre groupe possédant toute l'expertise et les outils requis pour accomplir un tel projet. Ces travaux permettront à l'avenir de corriger ou atténuer les phénotypes de ces patients.