MOllusc BIvalves as inDICators of contamination of water bodies by protozoan parasites. – MOBIDIC

La démarche utilisée dans le projet porte sur trois axes complémentaires :
- Améliorer l’extraction et la détection des protozoaires en matrices complexes (bivalves). Différents paramètres visant la préparation des matrices, l’élution/concentration des parasites à partir des matrices et l’extraction/purification des ADN de parasites ont été testés. Concernant la détection et la quantification, différentes approches moléculaires (qPCR, dd-PCR ou encore LAMP) ont été développées et comparées
- Définir la représentativité de la charge en protozoaires mesurée dans les bivalves vis-à-vis du niveau de contamination des masses d’eau. Ce volet est abordé par l’étude des cinétiques d’accumulation et de dépuration des trois protozoaires en conditions contrôlées de laboratoire en exposition simple pendant 21 jours suivi de 21 jours de dépuration en eau claire. Une deuxième expérimentation a été effectuée mais cette fois-ci en exposition simultanée des 3 protozoaires durant 7 jours suivi de 7 jours de dépuration.
- Améliorer nos connaissances sur les effets possibles de ces protozoaires sur la physiologie des bivalves. Une attention particulière a été portée sur le compartiment hémolymphatique incluant les cellules en charge de la défense immunitaire des mollusques. Etant donné l’absence d’information dans la littérature, nous avons choisi, sur la base d’exposition ex vivo, de développer d’une part une approche ciblée (marqueurs de cytotoxicité, phagocytose, d’apoptose, de nécrose…) et d’autre part une approche ouverte de protéogénomique afin d’identifier les modes d’action.

Les résultats les plus marquants de cette période concernent la mise en place de quatre nouveaux protocoles pour extraire et détecter les trois protozoaires dans les tissus et l’hémolymphe de la dreissène et la moule bleue. Outre leurs performances nettement supérieures à ceux de référence, la simplification de la procédure et la réduction du temps de traitement sur les tissus (notamment de moule bleue), constituent une réelle avancée et rupture par rapport aux méthodes existantes. La faisabilité et l’intérêt de la ddPCR pour la quantification des parasites a également été démontrée. Concernant la cinétique d’accumulation et de dépuration, les expositions en laboratoire ont montré que les 2 espèces de bivalves sont capables de bioaccumuler les 3 protozoaires de façon dose et temps dépendant, que ce soit en exposition simple ou simultanée. Concernant les réponses biologiques, le projet a permis l’acquisition de nouvelles connaissances vis-à-vis de marqueurs mis au point chez les hémocytes de dreissènes par des mesures en cytométrie et en dd-PCR. En complément de l’approche ciblée (période 1), l’approche protéomique a permis d’identifier de nombreuses protéines (671) modulées par C. parvum, ce qui permettra i) de préciser plus finement le mode d’action du protozoaire sur les hémocytes de dreissènes, et ii) identifier de potentiels biomarqueurs d’effet.

Le projet MOBIDIC concernait initialement exclusivement des approches en conditions contrôlées de laboratoire. Une évolution du WP2 est proposée et concernera l’application des nouveaux protocoles d’extraction et quantification des protozoaires dans les mollusques pour évaluer in situ la qualité des masses d’eau. Concernant la dreissène, cette approche bénéficiera d’échantillons prélevés dans différents projets en cours (ZA PIREN-Seine, Projet EQUAL AERM et INTERREG FWVL DIADeM). De plus, suite à l’approche comparative de protéomique, une centaine de protéines d’intérêt seront sélectionnées pour une détection et de quantification de façon simultanée en spectrométrie de masse.
La mise en place de protocoles performants pour la détection des parasites dans les deux espèces de bivalves ouvre des perspectives dans les domaines environnemental et également alimentaire. Ils permettront notamment de mieux caractériser l’exposition de l’homme à ces dangers émergents, par exemple dans le cadre de plans de surveillance.

Le projet, démarré depuis moins de 36 mois, est encore dans sa phase expérimentale et d’acquisition des données. Le projet fait l’objet actuellement de plusieurs communications, de deux chapitres d’ouvrage et de deux articles soumis ou en cours de soumission

Protozoa such as Cryptosporidium spp, Giardia duodenalis and Toxoplasma gondii are identified as public health priorities because of possible waterborne transmission to humans. Protozoa are currently detected by immunofluorescence (IF), except T. gondii, on samples from filtered water. Limitations have been identified for both the IF detection method (requires antibodies, high-level expertise, etc.) and the matrix (water). The use of the water matrix to monitor the contamination level of water bodies gives variable results that depend on physico-chemical and meteorological parameters that are particularly important in the present context of global climate change. This could represent a limitation when applying a monitoring approach based on this matrix. Bioaccumulation measurements of these protozoa in invertebrate species, mainly bivalve molluscs, could represent an alternative tool to evaluate water contamination and avoid the limitations due to the water matrix. They would also break away from current approaches to protozoa research. Advantages would be the integrative (temporal) character of pathogen loads in invertebrates and the representativeness of pathogen measurements according to site (attached organisms). For us to have tools applicable on a large spatial scale (freshwater-seawater continuum), two bivalve mollusc species will be considered: a coastal one (the blue mussel, Mytilus edulis), and a continental one (the zebra mussel, Dreissena polymorpha). Using the capacity of our indicator species to accumulate parasites as a tool requires overcoming various scientific challenges by answering questions centred around three main issues: 1- It is necessary to develop and validate a sensitive procedure for simultaneous protozoa extraction and detection, and strict quantification of protozoa (oo)cysts in a complex matrix such as bivalve molluscs. The consortium proposes to develop innovative, rapid and sensitive molecular approaches, with special focus on the crucial step of (oo)cyst extraction/purification from molluscs. 2- It will be necessary to determine whether the parasite loads measured in zebra mussel and blue mussel tissues are correlated with the levels of contamination. To that end, the consortium proposes to define the kinetics of protozoa bioaccumulation by bivalves during single or combined exposures under laboratory conditions. 3- The physiology of mussels, in link with environmental and endogenous parameters, could modify their capacity to accumulate pathogens. The MOBIDIC project proposes to investigate the potential effect of environmental parameters (temperature, food availability, chemical stress) on pathogen bioaccumulation. In addition, in light of the lack of data in the literature, the project proposes to investigate the potential effects of (oo)cysts on mussel’s health, particularly on immune responses. This project proposes to provide new knowledge about interactions between protozoa (Cryptosporidium spp., Giardia duodenalis., and T. gondii) and mussels, with the aim to define a reliable indicator of the biological quality of water bodies to preserve the quality of water resources and protect human health. The MOBIDIC project will also provide interesting data in ecotoxicology in a multi-stress context, i.e. cumulative/interacting effects between biological and chemical contaminants, to better estimate the risk related to global climate change. To achieve the different objectives, a multidisciplinary consortium will associate environmental sciences (ecotoxicology and ecophysiology) and the fields of health (parasitology) on the one hand, and academic, institutional and private partners to combine basic and applied research and transfer skills to stakeholders, on the other hand. To facilitate skill transfer, the consortium applied for the HYDREOS cluster label. Members of this cluster will participate to the advisory board of the project.