Blanc SVSE 5 - Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques

Revealing complexity of the plant phenolic metabolism : novel routes to the precursors of the cell-wall biopolymers – PHENOWALL

New tools and knowledge for optimization of biofuel production

Lignin is a major hurdle to biomass processing for biofuels production or pulping, as well as to forage digestibility. Crops improvement through metabolic engineering of lignin quantity and/or quality implies a good knowledge of its biosynthetic pathway.

Respective functions of the cytochromes P450 involved in the phenolic metabolism in Poaceae

Cytochromes P450 catalyze rate-limiting and irreversible oxidation reactions in the phenolic metabolism. Some of them have duplicated during early seed or monocotyledonous (cereals) plant evolution. These duplicates have been conserved in most plant species. Our aim in the PHENOWALL project was to determine the functional basis of these duplications, in order to be able to redirect fluxes toward the biosynthesis of soluble phenolics (antioxidants) or specific monolignols (building-blocks of the lignin biopolymer) to optimize plant phenolic composition and digestibility. The model used in this study was Brachypodium distachyon, the model plant for Poaceae, for which genetic tools have been and are still currently being developed. Our results are expected to generate knowledge and tools to improve seed composition for food and feed production and to optimize lignin composition for the production of biofuels, paper pulping and forage digestibility.

Target enzymes were expressed in microorganisms to determine their respective specific activities. Their expression profiles in the plant were defined. The role of each of them in the plant has been determined using knock-down and overexpression mutants, which have been analysed for their developmental phenotype and for soluble phenolics and lignin composition. Instrumental to this work were the recently implemented mutants collections at IGPB and in USA.

Results of PHENOWALL demonstrate that the duplication of the second enzyme of the phenolic metabolism during plant evolution lead to a functional diversification without modification of the principal enzyme activity: hydroxylation of cinnamic acid is carried out with similar efficiencies by the different duplicates (paralogs) in spite of significant differences in the structure of their active sites. The subcellular localization of the different paralogs expressed in a heterologous system (leaf epidermal cells) appears to be the same (endoplasmic reticulum membranes). Our results however show that their anchoring mode in the membranes is different and leads to a differential membrane topology. Moreover, one of the paralogs was found to be glycosylated. Analysis of their expression profiles during plant development shows that some of them are expressed in roots, reproductive organs, or are associated to specific cell types. Suppression and overexpression mutant analysis is still on-going. Preliminary results indicate either a moderate impact on plant development and lignin composition of the individual suppression of target genes, or a suppression of plant viability. The production of double mutants is under way to overcome functional redundancies. Mutant analysis carried-out in the project also revealed the function of other genes involved in the plant lignification
PHENOWALL also provided the basis and tools for the initiation of other collaboration with Canada (the Working On Wood project), Belgium, Germany and USA.
New projects initiated on the basis of PHENOWALL:
- METABEVO project: USIAS-FRIAS joint project with Freiburg University on phenolic metabolism evolution in moss 2013-2015 (partner 1)
- PEACH project: submitted to Institut Carnot 3BCAR on the production of férulic acid as high added value compound in Brachypodium
- BRAVO project: funded by ANR on the ontogeny of the vascular tissues in Brachypodium.

The PHENOWALL project will identify markers for modifying the phenolic composition and reticulation of lignin, in order to improve production of biofuels from cereals straws and stovers, and to improve forage digestibility. It should also contribute to reveal how to optimize phenolic composition of flowers and seeds/fruits. Preliminary data suggest impacts on plant development, flowering time and fertility. These data however require further validation.

Complete annotation of the cytochrome P450 genes from Brachypodium and discussion on evolution of the P450 family: Nelson D, Werck-Reichhart D. (2011) A P450-centric view of plant evolution. Plant J. 66:194-211.

New approaches for the analys

Le métabolisme phénolique utilise la phénylalanine pour produire les précurseurs des biopolymères pariétaux (lignine, subérine, sporopollénine, molécules de pontage) ainsi que de nombreux dérivés solubles (esters et amides phénoliques, flavonoïdes, coumarines, etc.), très abondants chez les plantes et présentant d’intéressantes propriétés anti-oxydantes ou organoleptiques. En dépit de l’importance économique de ces composés et d’une intensive ingénierie métabolique mise en œuvre pour améliorer la saccharification de la biomasse, la production du papier ou les qualités nutritives des plantes, le métabolisme phénolique et ses ramifications ne sont pas totalement élucidés. Les résultats des travaux d’ingénierie entrepris ces dernières années suggèrent en fait qu’une partie de ces ramifications sont restées ignorées. L’objectif de PHENOWALL est de révéler une partie de ces voies en s’appuyant sur une analyse fonctionnelle des paralogues de deux familles de cytochromes P450, CYP73 et CYP98, qui catalysent l’hydroxylation des cycles phénoliques en positions 3 et 4.
Les CYP73 utilisent l’acide cinnamique libre comme substrat. Des résultats récents indiquent que les CYP98 catalysent la meta-hydroxylation de plusieurs esters et amides des acides hydroxycinnamiques, avec une sélectivité très variable selon les enzymes. D’après la phylogénie, des duplications de ces familles de gènes sont intervenues très tôt dans l’évolution, avant même la divergence Monocotylédones-Dicotylédones pour CYP73. La fixation de ces duplications dans les génomes indique l’émergence de fonctions nouvelles dans le métabolisme phénolique. Nous proposons donc d’étudier les fonctions biochimiques et biologiques des paralogues de CYP73 et CYP98. Ce travail implique un criblage des activités catalytiques d’enzymes recombinantes et une étude fonctionnelle chez Brachypodium distachyon, qui s’impose actuellement comme un nouveau modèle des Graminées de grande culture telles que le blé et l’orge et des plantes ciblées pour la production d’agro-carburants de seconde génération.
Nous commencerons par identifier tous les gènes des familles CYP73 et CYP98 dans le génome de Brachypodium et préciserons leurs relations phylogénétiques. Les représentants de chaque sous-groupe seront sélectionnés et leurs spécificités catalytiques seront déterminées par expression chez la levure. Ce travail s’appuiera de la synthèse d’une librairie de substrats potentiels en complément d’une approche bio-informatique de modélisation des sites actifs et des interactions enzymes-substrats. En parallèle, les fonctions biologiques de chaque paralogue seront décrites par 1) la détermination de leurs patrons d’expression par des approches transcriptomique, PCR quantitative et constructions promoteur::GUS, 2) l’analyse phénotypique d’une série de mutants de TILLING, incluant l’analyse de leurs modifications biochimiques (polymères et composés phénoliques solubles) et développementales (fertilité, croissance).
Ce travail s’appuie sur la collaboration de 4 équipes de compétences très diverses et complémentaires, en enzymologie et génomique fonctionnelle des cytochromes P450, génétique de Brachypodium, analyse biochimique de la paroi et de la lignine, synthèse organique, bio-informatique et biochimie structurale. Il fournira une description complète de la relation philogénie/expression/structure/fonction des paralogues dans les familles d’hydroxylases CYP73 et CYP98. Il permettra ainsi de mieux appréhender la complexité du métabolisme phénolique, pour une ingénierie métabolique mieux ciblées et plus efficace visant à l’amélioration des qualités nutritives et à la production d’agro-carburants. Il permettra enfin de proposer de nouveaux précurseurs des polymères naturels ou artificiels pour des approches de biologie synthétique.

Project coordinator

Madame Danièle WERCK-REICHHART (CNRS - DELEGATION REGIONALE ALSACE) – daniele.werck@ibmp-ulp.u-strasbg.fr

The author of this summary is the project coordinator, who is responsible for the content of this summary. The ANR declines any responsibility as for its contents.

Partner

IBMP-CNRS CNRS - DELEGATION REGIONALE ALSACE
IJPB-INRA INRA - CENTRE DE RECHERCHE DE VERSAILLES GRIGNON
SMPSD-CNRS CNRS - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD
UDS UNIVERSITE DE STRASBOURG

Help of the ANR 500,000 euros
Beginning and duration of the scientific project: - 36 Months

Useful links