CE15 - Immunologie, Infectiologie et Inflammation

Deciphering tolerance breakdown in a human B-cell mediated autoimmune disease – Autoimmuni-B

Deciphering tolerance breakdown in a human B-cell mediated autoimmune disease

Which deregulation occurs in human autoimmune diseases and what is the dynamic contribution of each subset of B cells in this process is the central question of this proposal. We will take advantage of a unique model, the antibody-mediated autoimmune disease immune thrombocytopenia (ITP), in which different disease treatments and outcomes delineate distinct pathogenic effector subsets and for which splenectomy allows the study of tolerance breakdown during an immune response in a lymphoid organ.

Identifying the pathogenic B cell effectors in various therapeutic outcomes

(1) Does the reappearance of autoantibodies during disease relapses originate from the residual memory B cells that have survived the B cell depleting treatment, or do they come from newly formed naïve B cells? <br />(2) At what step of B cell development does the tolerance breakdown against platelet antigens occur (question modulated by our findings from question 1)? Is this mechanism restricted to defined platelet glycoprotein antigens, or does it target other epitopes or antigens, leading to the recruitment of effector cells in the germinal center in a bystander fashion? <br />(3) What is the affinity of the antibody secreted by the pathogenic plasma cells in different compartments (peripheral blood, spleen, and bone marrow obtained from the same individual), and different clinical situations (patients at diagnosis, at splenectomy or refractory to splenectomy): Is there a link between the location of these plasma cells and the affinity of the auto-antibodies they produce? Finally, do persisting autoimmune plasma cells present in bone marrow of refractory patients (not responding to both rituximab and splenectomy) display unique pro-inflammatory profiles as compared to vaccination-induced long-lived bone marrow plasma cells?

To determine the origin and repertoire of auto-immune B cell clones targeting GpIIbIIIa, the main platelet antigen target, in the spleen of ITP patients after B cell reconstitution, the consortium will use novel approaches. This will combine
1) a new in vitro single cell differentiation assay for human B cells allowing us to test their Ab specificity and to obtain anti-GpIIbIIIa VH sequences for memory and germinal center B cells,
2) innovative microfluidic systems allowing the identification of anti-GPIIbIIIa-specific single plasma cells (PC) and the affinity of the Ab they produce, their sorting and VH/VL sequencing. Sequences obtained for anti-GPIIbIIIa-specific single B cells will be searched in high-throughput sequencing data in order to identify clonally related cells in germinal center, memory B cells and PC and then provide for the first time a global view of an auto-immune response in the human spleen.

- Identification of a rituximab-resistant memory B cell subset with unique characteristics, allowing it to survive the B-cell depletion in a dormant state and to become reactivated after clearance of the drug. This rituximab-resistant subset is vulnerable to anti-CD19 therapy in vitro, suggesting new therapeutic interventions in this disease
- Identification of anti-GPIIbIIIa plasma cells within distinct lymphoid compartments and harboring a wide range of affinities by microfluidic assays

- characterization of plasma cell gene expression profiles in pathological contexts, based on paired blood, spleen and bone marrow samples
- isolation of GPIIbIIIa-specific plasma cells for Ig repertoire sequencing and correlation with antigen affinity

«Rituximab-resistant splenic memory B cells and newly-engaged naive B cells fuel relapses in patients with immune thrombocytopenia«
Crickx, E., Chappert, P., Sokal, A., Weller, S., Azzaoui, I, Vandenberghe, A., Bonnard, G., Rossi, G., Fadeev, T., Storck, S., Fadjallah, J., Meignin, V., Rivière, E., Audia, S., Godeau, B., Michel, M., Weill, J.-C., Reynaud, C.-A. and Mahévas, M.
Sci. Transl. Med., in press (2021)

La question centrale de ce projet est de comprendre quel mécanisme de dérégulation survient dans les maladies auto-immunes et quelle est la contribution dynamique de chaque sous-population de cellules B dans ce processus. Nous tirerons profit d’un modèle unique dans lequel différents scénarios cliniques, au cours de la Thrombopénie Immunologique (PTI), illustrent des aspects fondamentaux multiples. En premier lieu, cette étude se focalisera sur les patients splénectomisés 6 mois après la déplétion B pour une rechute, ce qui offre l’opportunité d’étudier la maladie avant tout traitement avec un accès à l’organe cible (la rate) et permet d’explorer les différents événements de rupture de tolérance. Pour déterminer, dans la rate des patients PTI, l’origine et le répertoire après reconstitution lymphocytaire B des clones B anti-GPIIbIIIa (principal antigène plaquettaire), ce projet utilisera de nouvelles approches qui combineront 1) un nouveau système de différentiation de cellules B permettant de tester la spécificité et d’obtenir les séquences VH des cellules B mémoires et des centres germinatifs en cellule unique 2) des systèmes de microfluidique innovants permettant l’identification, la caractérisation, le tri et le séquençage des plasmocytes (PC) anti-GPIIbIIIa. Les séquences anti-GPIIbIIIa spécifiques seront alors confrontées aux données obtenues par séquençage à haut débit afin d’identifier des relations clonales dans les cellules B mémoires, du centre germinatif et des PC, fournissant pour la première fois une vision globale d’une réponse auto-immune dans la rate humaine.
Les rechutes observées après déplétion B durant le redémarrage de la lymphopoïèse B suggèrent un défaut de sélection négative des clones auto-réactifs. A quelle étape du développement B survient la rupture de tolérance contre les antigènes plaquettaires, et si ce mécanisme est restreint ou non aux antigènes plaquettaire est la seconde question de ce projet. Pour étudier les points de contrôle de tolérance du développement B, nous utiliserons notre systéme de culture en cellule unique, pour tester la polyréactivité (anti-dsDNA, insuline, LPS) et l’autoréactivité contre les antigènes plaquettaires dans les cellules B immatures (tolérance centrale) et les cellules B naïves (tolérance périphérique) dans la rate des patients PTI et des donneurs sains. Une des hypothèses est que l’excès de BAFF qui est observé dans le sérum et dans la rate après déplétion B pourrait modifier le seuil de sélection négative des cellules B autoréactives nouvellement formées. Ceci sera aussi testé dans les cellules sanguines des patients au cours d'un essai prospectif dans lequel la déplétion B (Rituximab) est réalisée en présence ou non d’un anticorps anti-BAFF (Belimumab) jusqu’à la reconstitution B.
Enfin, l’environnement autoimmun pourrait induire des modifications intrinsèques des plasmocytes (PC). Les plasmocytes spléniques des patients PTI ont, dans leur ensemble, une signature transcriptionnelle particulière, mais il n’était pas jusqu’à ce jour possible de lier la spécificité antigénique à un profil transcriptionnel. Pour comparer des populations pures de PC, nous étudierons la moelle osseuse de patients, 6 mois après splénectomie et Rituximab. En utilisant un système de double détection des PC anti-GPIIbIIIa et anti-tétanos, le consortium réalisera une analyse de RNAseq en cellule unique après tri cellulaire. L’analyse de ces PC spécifiques, en l’absence de cellules B mémoires, donnera une signature unique de PC à longue durée de vie générés dans une réponse immune chronique. Ce projet aidera à comprendre les mécanismes fondamentaux qui conduisent à la rechute et à la rupture de tolérance dans un modèle de maladie auto-immune médiée par les anticorps et donnera l’opportunité unique d’étudier la signature moléculaire des plasmocytes pathogéniques. Ceci pourrait aider à développer de nouveaux marqueurs et de nouvelles cibles thérapeutiques.

Project coordinator

Madame Claude-Agnès REYNAUD (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE)

The author of this summary is the project coordinator, who is responsible for the content of this summary. The ANR declines any responsibility as for its contents.

Partner

INSERM INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE
IP INSTITUT PASTEUR

Help of the ANR 518,754 euros
Beginning and duration of the scientific project: October 2018 - 36 Months

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