Proteomics for novel biomarkers relevant in ecotoxicology from gammarids : challenging the biodiversity and multiplexed immunoassay as diagnostic tool – ProteoGam

L’identification des protéines d’intérêt et sexe-spécifiques, ainsi que leur validation physiologique ont été possibles en croisant d’une part les connaissances en physiologie et écophysiologie que l’on disposait chez le gammare et l’utilisation du protéome précédemment défini chez G. fossarum et d’autres part nos compétences en spectrométrie de masse haute résolution. L’approche innovante protéogénomique, couplant l’étude simultanée du transcriptome et du protéome pour un tissu cible ou chez un organisme cible, va être mise en oeuvre pour diverses espèces de gammare, ceci dans le but d’une part de produire une base de données protéiques pour chaque espèce étudiée et d’autre part d’identifier les séquences conservées et proposer des peptides protéotypiques « universels » entre espèces pour chaque protéine d’intérêt. Le projet sera également l’occasion, pour la première fois en science environnementale, de développer une approche analytique innovante pour la mesure des biomarqueurs. L’objectif est de proposer une méthode par immunoassay, mais également multiplexée. L’innovation réside d’une part dans le développement d’anticorps dirigés contre des peptides protéotypiques et dans le développement de l’approche Luminex® qui permet d’identifier et quantifier spécifiquement des anticorps présents en mélange. Enfin, et d’un point de vue méthodologie, il est proposé d’utiliser une approche de surveillance active (encagement d’organisme) dans le but d’évaluer la pertinence pour chaque biomarqueur retenu et de lui associer une référence intégrant sa variabilité naturelle au regard des facteurs environnementaux autres que la contamination

Les premiers résultats de ces travaux ont permis d’identifier des protéines d’intérêt comme biomarqueurs de perturbations endocriniennes chez notre espèce sentinelle G. fossarum. Pour quatre de ces protéines, des anticorps spécifiques dirigés contre les peptides protéotypiques ont été obtenus et ont permis de développer une méthode de dosage, aujourd’hui en multiplex, de ces protéines. Dans le même temps, les travaux sur le protéome de G. fossarum ont conduit à la mise en place d’une nouvelle collaboration avec A. Salvador (ISA-Lyon), ayant permis de développer des approches en spectrométrie de masse pour de la quantification de protéines d’intérêt. Les travaux menés ont permis, pour la première fois, de valider la preuve de concept d’une telle approche chez un invertébré aquatique et ont donné lieu à la proposition d’une méthode spécifique pour la mesure de biomarqueurs couramment utilisés en écotoxicologie aquatique et ce de façon multipléxée.

Les sorties de ce projet sont d’un intérêt majeur pour le suivi de la contamination chimique et de la toxicité des milieux, notamment dans le cadre de la DCE. Ces travaux permettront de répondre à un manque crucial d’outils pour évaluer les effets des perturbateurs endocriniens dans les milieux et vis-à-vis des invertébrés, alors que des observations soupçonnant fortement leur présence existent. Les résultats de ces travaux doivent alimenter la démarche de transfert des outils d’écotoxicologie pour leur utilisation dans la surveillance, via la recommandation des acteurs de l’eau.

Les premiers résultats de ce projet ont été très bien valorisés, au travers de six publications internationales, un chapitre d’ouvrage et six communications en congrès

Hazard assessment of endocrine disruptors raises currently great concerns, especially for invertebrate species. Similarly to scientific researches and tools developed to study endocrine disruptors impacts on vertebrates, national and European expert advisory groups have recently highlighted the need to develop relevant tools for the identification and the assessment of mode of action involved in toxic effects on key physiological functions for invertebrates. Despite the obvious importance of gammarids for aquatic ecosystem functioning, their widespread use in aquatic ecotoxicology (both for laboratory and field experiments) and the different markers of toxicity available, any direct and validated biomarkers are currently available to understand the mode of action of endocrine disruptors and to diagnose their impact. This is the result of the knowledge gap on the endocrine regulation of reproduction in some crustaceans such as amphipods, in relation to the lack of genomic data for non-model species. Recently, a novel approach intimately combining genomic and proteomic methodologies, namely proteogenomics, has emerged for a straightforward strategy for discovering proteins in non-model organisms. For the first time in macro-invertebrates, our research teams have recently conducted a large proteogenomic survey in our sentinel species G. fossarum, allowing a characterization of gammarids’ reproductive function, through the identification and characterisation of novel key proteins. Thanks to new omic techniques, ProteoGam proposes to develop new generation of endocrine disruptor (ED) biomarkers, making possible their use for field survey.
The first objective of the proposal is to develop and propose relevant ED biomarkers for the crustacean G. fossarum in order to improve hazard assessment of pollutants in aquatic systems. The second objective aims to propose transferable (universal) analytical methods for measuring proposed ED biomarkers on Gammarus species, in order to investigate the vulnerability of gammarid populations to ED and the relevance of G. fossarum as a surrogate species of gammarid diversity. In parallel, to quantify these biomarkers, a new approach based on the Luminex xMAP® technology will be implemented. This methodology allows developing multiplex immunoassays to quantify simultaneously some biomarkers in a single analysis, through the identification and quantification of proteotypic peptides for each biomarker.
Based on large transcriptome dataset available on our reference population of G. fossarum, specific proteins of the male and female reproductive tract will be identified, and among them, candidates for endocrine disruptor biomarkers will be proposed according to (i) describing their pattern during the reproductive cycle via proteomic shotgun analysis and and (ii) assessing their sensitivity towards models compounds and during field experiments. To address the representativity of G. fossarum as a surrogate species toward gammarid diversity in regard to the impacts of ED, a proteogenomic approach will be performed on five species mostly observed in France and Europe, i.e. G. fossarum, G. pulex, G roeseli, G. tigrinus and Dikerogammarus villosus. Pan-proteomes will be recorded on ovary and testis of animals from the five species and interpreted based on a pan-RNAseq derived database. This comparative high-throughput proteomic approach will allow deciphering a set of proteotypic peptides that could be specific of proteins identified as ED biomarker in G. fossarum, but conserved amongst the different species, thus “universal” ED biomarkers for European Gammarus species.
ProteoGam will thus (i) improve knowledge on ecophysiology of G. fossarum, especially proteins playing a key role in reproduction, (ii) exemplify the relevance of new omic approaches for biomarkers development, and (iii) propose an original validated multiplex assay as a diagnostic tool for field survey of ED impacts.