Santé et Bio technologies Nanobiotechnologies

Caractérisation phénotypique et moléculaire de cellules tumorales circulantes. Utilisation de nanoparticules photoluminescentes pour la quantification des protéines et acides nucléiques d'intérêt.

NanoCTC

Keywords: Cancer, circulating tumor cells, epithelial-mesenchymal transition, fluorescent semiconductor nanocrystals, FRET, time-gated microscopy, phage display, microarray, high-throughput & high-content immunofluorescence image analysis

Summary

Objectif général : identifier par une signature phénotypique et moléculairedes sous-populations de cellules tumorales circulantes (CTC) susceptibles d’engendrer les métastases, en développant un ensemble de technologies qui reposent notamment sur l’utilisation de nanoparticules et du transfert résonant d’énergie (FRET) et permettront de mieux caractériser et détecter les CTC.

Problématique – Les CTC sont des cellules présentes en très faible proportion (1 cellule/106 cellules normales) dans la circulation sanguine. Elles jouent un rôle important dans le processus de métastase responsable de la majorité des décès de patients atteints de cancer. La caractérisation phénotypique et moléculaire des CTC est susceptible d’apporter des informations cliniques, pour identifier des bio-marqueurs pronostiques et/ou prédictifs, et biologique pour mieux comprendre certaines étapes de la progression métastatique et améliorer ainsi la survie des patients. D’un point de vue clinique, il a été démontré que la concentration de CTC épithéliales était un facteur pronostic puissant, cependant les méthodes de mesure des CTC « en cours de transition épithélio-mésenchymateuses »(EMT) potentiellement les plus agressives manquent de sensibilité. Aussi il est utile de développer des outils permettant de mieux détecter ces cellules. L’identification de marqueurs moléculaires prédictifs de réponses à des traitements ciblés dans les CTC est un domaine de recherche extrêmement actif avec pour perspective l’utilisation de ces cellules comme « biopsie liquide », mais peu de résultats ont été publié du fait de la complexité technologique liée à l’extrême rareté et à l’hétérogénéité moléculaire des CTC. Par ailleurs on connait encore très mal les caractéristiques biologiques de ces cellules. Bien que l’importance de l’EMT soit de plus en plus reconnue, son rôle au sein des tumeurs primitives et des métastases n’est pas élucidée. Les CTC pourraient être considérées comme le chaînon manquant. Aussi, le développement de nouveaux outils de détection et d’analyse des CTC, dans le cadre du projet NanoCTC, contribuera à une meilleure compréhension de la progression tumorale.

Faits marquants (liste des références citées entre [] en Annexe 1)

  1. Sélection de la lignée A549 (carcinome pulmonaire) co-exprimant des marqueurs de l’EMT (E-/N-cadhérines) [ENSC-LBPA] [1] ; mise au point d’un protocole d’identification automatisée, par immunofluorescence à haut débit et algorithme dédié [IMSTAR], de cellules A549 dispersées en faible proportion (0.3 %) dans du sang [IGR-LRT & ENSC-LPQM/LBPA] (Figure 1).
  2. Imagerie résolue en temps de E- et N-cadhérine à la membrane de cellules (diverses lignées dont A549), marquées avec un complexe de terbium (TbL4). Validation de l’imagerie par transfert d’énergie entre le donneur TbL4 et des différents accepteurs colorants organiques [1].
  3. Couplage d’anticorps anti E-/N-cadhérine à des QDots « maison », en conservant l’orientation de l’anticorps (manuscrit en cours de finalisation) [ESPCI-LPEM].
  4. Fonctionnalisation de nanodiamants avec des PNA [2] puis couplage du complexe à des acides nucléiques et anticorps pour capturer la signature moléculaire des CTC sur « microarrays » [CEA]
  5. Développement (par phage display) d’un anticorps anti E-cadhérine, et d’un hémi-anticorps possédant un brin PNA capable de reconnaître une séquence nucléotide d’intérêt [CEA-SREIT].
  6. Caractérisation le statut de marqueurs de l’EMT sur des CTC de patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) et de cancer de la prostate [IGR-LRT].

Bilan – Le projet a montré que le système Imstar pouvait identifier une très faible fraction de cellules rares par immunofluorescence. Le choix des E/N-cadhérines comme marqueurs de l’EMT, s’est avéré inadapté aux CTC de patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules et de cancer de la prostate. Le développement des hémi-anticorps et leur implémentation sur microarrays, ainsi que celui des QDots fonctionalisés avec différents anticorps n’ont pas pu être achevés mais continuent actuellement. Nous n’avons pas observé de FRET entre les marqueurs fluorescents de la E- et N-cadhérine, alors que nous comptions sur la spécificité de ce signal pour identifier plus efficacement des candidats CTC. Néanmoins, nos résultats fournissent au final un ensemble de technologies qui amélioreront la détection et la caractérisation des CTC.

The author of this summary is the project coordinator, who is responsible for the content of this summary. The ANR declines any responsibility as for its contents.

General informations

Acronym: NanoCTC
Reference Number: 10-NANB-0005
Project Region: Île-de-France
Discipline: 5 - Bio Med
PIA investment: 1,485,173 €
Start date: September 2011
End date: December 2014

Project coordination : François TREUSSART
Email: francois.treussart@ens-cachan.fr

Consortium du projet

Etablissement coordinateur : Ecole Normale Supérieure de Paris-Saclay
Partenaire(s) : CEA Paris, CEA Fontenay-aux-Roses, Ecole Normale Supérieure de Paris-Saclay, Institut Gustave Roussy, Imstar, CNRS Paris Villejuif, Université Paris-Saclay

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