Dynamique de l'organisation de chromatine au cours de la reproduction – DYSCORD

Objectif 1. Création de collections ANCHOR multi-fluorophores.

Trois paires de systèmes ANCHOR (OR1-ANCH1, OR2-ANCH2, OR4-ANCH4) sont disponibles mais seule OR2-ANCH2 a été validée chez la plante. Différentes constructions moléculaires comprenant la séquence ANCH1, 2 ou 4 et un gène codant OR (1, 2, ou 4) fusionnée à une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur constitutif ont été synthétisés et transférés dans les plantes. La fluorescence générée dans le noyau des cellules de racines (fluorescence uniforme ou focalisé, intensité) pour chaque lignée ANCHOR (transformants T1) est analysée en microscopie confocale.

Objectif 2. Pour l’étude de l’appariement des chromosomes en méiose, une construction moléculaire ANCHOR exprimant OR2 fluorescente sous le contrôle d'un promoteur méiose-spécifique a été générée et transférée dans les plantes. La robustesse du signal fluorescent de différentes lignées ANCHOR est évaluée par microscopie confocale en time-lapse sur des méiocytes mâles dans les anthères. Dans un deuxième temps la localisation du transgène ANCHOR dans le génome sera déterminée.

Objectif 3. Pour suivre la dynamique des allèles d’un gène et leur état transcriptionnel, une construction moléculaire DUAL a été synthétisée. Elle comprend un module ANCHOR pour suivre la position et la dynamique d'un gène et un module MCP–MS2 pour imager l’expression des ARNm correspondants. L'intensité et la localisation de la fluorescence produite par ANCHOR et MCP-MS2 sont évaluées dans les tissus végétatives et reproducteurs par microscopie confocale.

Objectif 1.

Depuis le début du projet, 745 lignées transgéniques ont été générées avec le système ANCHOR2 (OR2-anch2), comprenant la séquence ANCH2 et le gène codant OR2 fusionnée à une protéine fluorescente (mScarlet, mStayGold) sous le contrôle d'un promoteur fort constitutif. Ces lignées représentent autant de marquage à différents endroits du génome d’Arabidopsis thaliana. Par ailleurs, 19 lignées exprimant OR2-mStaygold sous un promoteur méiose spécifique exprimant OR2-StayGold ont été obtenues. Concernant les autres systèmes ANCHOR, une petite collection de 42 lignées a été générée avec le système ANCHOR1 (OR1-anch1) munie d'une protéine fluorescente verte mNeonGreen. Cependant ce construit génère par défaut un signal nucléolaire parasite nécessitant la génération de nouveaux constructions moléculaires utilisant à la place mStayGold.

Objectif 2.

La première phase du projet a été consacrée à l’adaptation de la technologie ANCHOR à l’analyse de l’appariement des chromosomes en méiose. Nous avons désormais validé une série de lignées « meioANCH » dans lesquelles les loci ANCH peuvent être visualisés dans les méiocytes sur de longues périodes de temps (plusieurs heures). En utilisant des plantes homozygotes pour le locus ANCH, nous avons pu observer pour la première fois l’appariement des chromosomes homologues in vivo dans des tissus végétaux. Cette approche nous permet de distinguer les stades au cours desquels les deux loci homologues ANCH se comportent de manière indépendante de ceux où ils sont étroitement associés.

Objectif 3.

Un des objectifs du work package 3 est le suivi simultané de la dynamique subnucléaire des allèles de gènes soumis à l'empreinte et de leur activité transcriptionnelle en temps réel au cours du développement de l'albumen. L’analyse conjointe de la dynamique des allèles et de la transcription au locus endogène n'est actuellement pas réalisable du fait de la faible efficacité des approches d'intégration ciblée (knock-in). En alternative, nous avons mis en œuvre une stratégie reposant sur la conception d'un transgène synthétique appelé DUAL, combinant un module de marquage ANCHOR destiné au suivi de la dynamique des allèles et une cassette d'imagerie des ARNm utilisant le système MCP-MS2. Une première construction moléculaire pilote DUAL a été synthétisée. La présence de128 répétitions de MS2 a entraîné une forte instabilité du plasmide, retardant considérablement l'obtention des premières lignées transgéniques. Les premières observations en microscopie confocale sur des cellules racinaires ont révélé une fluorescence uniforme de MCP-mStaygold et sous la forme de foyers pour OR-mScarlet2x.

Malgré l'utilisation d'un promoteur constitutif pour chaque rapporteur et l'emploi de protéines fluorescentes de dernière génération, le niveau de fluorescence détecté demeure insuffisant les noyaux de l'albumen pour poursuivre les analyses.

Objectif 1. L'objectif est d'augmenter le nombre de lignées ANCHOR1 pour atteindre environ 2000 lignées et caractériser pour plusieurs centaines la localisation du transgène dans le génome. La capacité de marquage de régions de l'ADN du système ANCHOR4 (OR4-anch4) est en cours d'évaluation. A terme deux collections restreintes d’environ 100 lignées indépendantes seront établies respectivement pour les systèmes ANCHOR1 et ANCHOR4

Objectif 2. Sur la base des lignées meioANCH déjà générées, nos travaux se concentrent désormais sur les phases de transition, afin de comprendre comment les chromosomes homologues entrent initialement en contact dans le noyau et comment ces premières interactions sont stabilisées au cours du processus.

Objectif 3. De nouvelles constructions DUAL sont en cours de synthèse afin de tester leur fonctionnement dans un premier temps au sein en cellules somatiques.

La reproduction sexuée chez les plantes comprend une succession de phases de développement qui génèrent d'abord des spores haploïdes génétiquement distinctes au cours de la méïose. Après plusieurs cycles de division, les spores mâles et femelles finissent par se différencier respectivement en deux gamètes mâles et deux gamètes femelles (cellule œuf, cellule centrale). La double fécondation des gamètes produit alors un embryon et son tissu nourricier, l'albumen, qui se développent tous deux au sein d'une graine. Au cours de ces phases, des changements massifs dans les compartiments cellulaires, de l'architecture des chromosomes et de la structure de la chromatine se produisent dans un laps de temps relativement court. Malheureusement, ces événements dynamiques se déroulent au sein des organes floraux et dans un nombre limité de cellules, ce qui complique les recherches et a laissé de nombreuses questions en suspens pendant de nombreuses années. Des protocoles d'imagerie en direct ont été développés et permettent maintenant d'observer les cellules reproductrices directement à partir de tissus vivants pendant toutes les phases clés de la reproduction des plantes (méiose, gamétogenèse, fécondation, embryogenèse).
Le développement récent, par les partenaires du projet, du système ANCHOR - un nouveau système de marquage de l'ADN - permet de suivre en temps réel la dynamique d'un locus unique dans une cellule vivante. ANCHOR comprend une protéine OR fusionnée à un rapporteur fluorescent qui se lie à une séquence cible ANCH. Ce nouvel outil offre une possibilité sans précédent et complémentaire aux approches d'imagerie pour répondre aux questions liées à la dynamique des chromosomes dans les tissus reproducteurs vivants. En tirant parti du système ANCHOR et en le couplant à d’autres approches de marquage très pointues, le projet DYSCORD vise à mieux comprendre deux étapes importantes de la reproduction (la reconnaissance des chromosomes parentaux pendant la méiose et l'empreinte génomique dans l'endosperme). Dans le work package 1, une collection de lignées d’Arabidopsis thaliana possédant le système de marquage ANCHOR distribué dans l'ensemble du génome sera générée afin de pouvoir observer simultanément et en temps-réel jusqu'à trois loci non liés dans un seul et unique noyau. A noter que cette collection sera accessible à l’ensemble de la communauté scientifique. Dans le second work package, nous étudierons la dynamique des chromosomes pendant la méiose, une étape au cours de laquelle les chromosomes parentaux sont étroitement associés les uns aux autres. Nous utiliserons les lignées ANCHOR pour déterminer la dynamique des interactions entre chromosomes homologues et comparer le comportement de différentes régions chromosomiques soit dans le type sauvage et dans des mutants méiotiques. Le work package 3 se concentrera sur la compréhension du comportement des gènes soumis à l'empreinte parentale caractérisés par une expression monoallélique pendant le développement de l'albumen en s'appuyant sur l'imagerie en temps-réel. La dynamique des différents allèles parentaux fluorescents marqués par ANCHOR et leur activité transcriptionnelle à l'aide de technologies d'imagerie basées sur l'ARN en direct seront visualisées simultanément pendant le développement de l'albumen chez le type sauvage et chez les mutants rétablissant l'expression biallélique de ces gènes soumis à l'empreinte.
Les résultats obtenus dans le cadre de DYSCORD sur A. thaliana profiteront à l'ensemble de la communauté scientifique travaillant dans le domaine de la méiose et de la reproduction, mais généreront également plusieurs réalisations techniques révolutionnaires en biologie cellulaire et en imagerie en temps réelle, qui devraient profiter à l'ensemble de la communauté scientifique végétale.