Réseaux de fibres 3D pour l'analyse automatique de la dynamique cellulaire – FibersForCells

Notre but est de reproduire de manière simplifiée un ensemble de propriétés génériques de la matrice extracellulaire, et notamment d’avoir accès à des phénomènes d’exploration de réseaux 3D de fibres déformables, isotropes ou non, ou de migration selon des gradients de rigidité ou des gradients topographiques (durotaxie et topotaxie). Nous avons ainsi pu construire par polymérisation deux-photons un ensemble de grilles 3D de fibres déformables avec maillages réguliers ou gradients d’espacements, de rigidité ou de réticulation, et avec ou sans piliers verticaux.

Ces grilles sont basées sur le développement de différents types de chimie, permettant de réaliser (I) des fibres synthétiques et (II) des fibres naturelles en protéines. (I) Pour les fibres synthétiques, nous utilisons d’une part des fibres de diacrylate de polyéthylène glycol (PEGDA ; recouvertes de fibronectine) pour une modulation optimale des propriétés mécaniques, avec modulation des propriétés adhésives par la longueur de la chaîne du PEGDA, et d’autre part des développements basés sur la chimie thiol-ène qui permettent de réaliser une fonctionnalisation de surface locale. (II) Nous avons développé un système basé sur la polymérisation d’une protéine globulaire, la BSA (Albumine de Sérum Bovin), avec adjonction de protéines de la matrice extracellulaire qui confère des propriétés adhésives aux fibres. Ces fibres naturelles se rapprochent de caractéristiques de la matrice par leurs propriétés biodégradables et viscoélastiques.

Un des grands atouts de notre système repose sur la détection intégrée des forces 3D exercées par les cellules, d’après l’analyse automatique de la déflexion 3D des fibres, la caractérisation des propriétés mécaniques par Microscopie à Force Atomique, et le développement d’un modèle d’éléments finis.

Nous avons étudié dans ces grilles de fibres le comportement d’un éventail de cellules marquées pour l’actine et le noyau : fibroblastes, cellules tumorales avec différentes propriétés invasives, et cellules immunitaires – macrophages, cellules dendritiques, lymphocytes T et neutrophiles, avec acquisition de séquences d’images dynamiques par des techniques de spinning disk ou de microscopie Lattice Light Sheet.

Notre but est de définir de manière systématique des descripteurs du comportement cellulaire, à l’échelle globale (forme cellulaire, migration et biais de migration, forme et déformation du noyau) ou locale (forces 3D locales, dégradation locale, protrusions cellulaires). Ces résultats nous permettront de définir des optimums d’organisation cellulaire et d’avoir accès de manière systématique à l’influence des différents paramètres géométriques de la matrice.

Nous avons pu construire par polymérisation deux-photons un ensemble de grilles 3D de fibres suspendues et déformables : maillages réguliers ou gradients d’espacements, de rigidité ou de réticulation. Nous pouvons moduler les configurations en jouant sur les contacts ou l’absence de contact entre les fibres, et sur l’absence ou la présence de piliers verticaux.

Du point de vue de la chimie, nous avons caractérisé plus avant les propriétés adhésives ou non de différents mélanges basés sur le PEGDA, et finalisons le travail sur la fonctionnalisation de surface des résines thiol-ene. Nous avons également étudié de manière détaillée les fibres en protéines basées sur la BSA, avec adjonction de fibronectine ou de collagène dans le mélange photopolymérisé.

Nous avons caractérisé la dynamique d’un éventail de cellules : fibroblastes, cellules de tumeurs du sein ou du rein avec différentes propriétés invasives, et cellules immunitaires – macrophages, cellules dendritiques, lymphocytes T et neutrophiles. Dans un premier temps, nous avons réalisé un ensemble d’acquisitions sur des réseaux comprenant deux ou trois étages de fibres suspendues parallèles entre elles, en jouant sur des paramètres tels que l’espacement entre fibres ou la disposition relative des couches en z. Ces expériences ont été réalisées principalement sur le système en PEGDA, et sur des fibres en protéine pour les fibroblastes et les neutrophiles. Nous nous sommes particulièrement axés sur le comportement des neutrophiles dans un ensemble d’architectures mimant de manière simplifiée les réorganisations de la matrice observées autour des tumeurs, et avons développé un pipeline d’analyse des trajectoires et de la morphologie, décrit dans un papier de méthodes soumis.

Enfin, notre méthode innovante de quantification des forces 3D dans les réseaux de fibres constitue un des maillons centraux du projet, et est publiée depuis octobre 2025.

Ce projet interdisciplinaire, actuellement dans une phase de développement rapide, s’appuie sur un fort réseau collaboratif couvrant les champs de la biomécanique, de la technologie et de la biologie cellulaire. La mise au point de ce système de fibres 3D sera d’un intérêt général pour la communauté des biologistes : en effet, il permet de mimer un grand nombre d’organisations génériques de la matrice extracellulaire observées dans des situations physiologiques ou pathologiques, comme des gradients de densité de fibres ou de rigidité. De manière générale, le développement de ce système de fibres 3D pleinement contrôlées ouvrira la voie à des applications pour le criblage de molécules ciblant la migration, les forces de traction ou l'état de différenciation. Au-delà des cellules individuelles, l’analyse des interactions entre cellules dans ces réseaux 3D bénéficiera à de nombreux champs d’étude, comme la reconnaissance immunitaire, la formation de myotubes, l'angiogenèse ou la migration collective à partir de sphéroïdes tumoraux. Notre projet est basé sur l’étude de réseaux de fibres 3D génériques avec des architectures simplifiées, mais les développements technologiques réalisés en polymérisation biphotonique pourront être utilisés pour des approches reconstituant toute la complexité de la matrice 3D à partir d'images in vivo. Enfin, des structures réalisées par polymérisation biphotonique ont été proposées en médecine régénérative, et la construction de réseaux 3D contrôlés de fibres de collagène ouvrirait une nouvelle possibilité de transfert vers des bio-implants.

Productions reliées antérieures :

1. Ucla P, Ju X, Demircioglu M, Baiz S, Muller L, Germain S, Monnot C, Semetey V, Coscoy S. (2022) Dynamics of endothelial engagement and filopodia formation in complex 3D microscaffolds. Int. J. Mol. Sci., 23(5), 2415. Special Issue 3D Printing and Biomaterials for Biological and Medical Application. doi.org/10.3390/ijms23052415

2. Coscoy S, Baiz S, Octon J, Rhoné B, Perquis L, Tseng Q, Amblard F, Semetey V. (2018) Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13(4):041003. doi: 10.1116/1.5024601.

Le but du projet FibersForCell est de construire des architectures de fibres 3D d’architecture, chimie et propriétés mécaniques contrôlées à l’échelle subcellulaire, puis d’y quantifier automatiquement la dynamique cellulaire (migration, activités protrusives) et les forces 3D exercées. Afin de reproduire des organisations prototypiques caractéristiques des matrices extracellulaires natives, dont les propriétés contrôlent le comportement cellulaire, nous nous baserons sur la technique de polymérisation deux-photons pour laquelle le consortium a développé précédemment une expertise en contrôlant la chimie, l’architecture et l’analyse automatique des comportements cellulaires induits par la microtopographie. Nous relèverons les défis consistant à reproduire les différents types d’architecture, à développer les techniques chimiques de fonctionnalisation de surface et de photopolymérisation de protéines - en nous concentrant sur la polymérisation de collagène et dérivés, et l’étude et le contrôle de leur dégradation -, puis à mettre au point la quantification des forces 3D exercées par les cellules et l’application de stimulations mécaniques supplémentaires globales ou locales, et enfin à automatiser l’analyse automatique d’images. De manière concrète, nous développerons un ensemble de grilles 3D de fibres déformables avec maillages réguliers ou gradients d’espacements, de rigidité ou de réticulation, dans l’optique de reproduire de manière simplifiée un ensemble de propriétés génériques de la matrice extracellulaire, et notamment d’avoir accès à des phénomènes d’exploration de réseaux 3D de fibres déformables, isotropes ou non, ou de migration selon des gradients de rigidité ou des gradients topographiques (durotaxie et topotaxie). Ces grilles seront basées sur deux types de chimie : fibres de diacrylate de polyéthylène glycol (recouvertes de fibronectine) pour une modulation optimale des propriétés mécaniques, ou de collagène pour le caractère biomimétique et dégradable, avec la possibilité d’assemblages composites. Enfin, une des grands atouts du système repose sur la détection intégrée des forces 3D exercées par les cellules. Nous étudierons dans ces grilles le comportement d’un éventail de cellules marquées pour l’actine et le noyau : fibroblastes, cellules tumorales avec différentes propriétés invasives, et cellules immunitaires - macrophages et cellules dendritiques. L’acquisition de séquences d’images par des techniques de spinning disk ou de microscopie Lattice Light Sheet, et le développement d’analyse d’images basée sur des techniques d’intelligence artificielle, nous permettront de définir de manière systématique des descripteurs du comportement cellulaire, à l’échelle globale (forme cellulaire, migration et biais de migration, forme et déformation du noyau) ou locale (forces 3D locales, dégradation locale, protrusions cellulaires). Ces résultats nous permettront de définir des optimums d’organisation cellulaire et d’avoir accès de manière systématique à l’influence des différents paramètres géométriques de la matrice. Ce projet interdisciplinaire, actuellement dans une phase de développement rapide, s’appuie sur un large corpus de résultats préliminaires du consortium et sur un fort réseau collaboratif couvrant les champs de la chimie, de la microfabrication, de la biomécanique, de l’imagerie et de la biologie cellulaire. La mise au point de ce système de fibres 3D sera d’un intérêt général pour la communauté des biologistes. Les avancées technologiques en chimie et microfabrication pourront par la suite bénéficier à d’autres types d’études visant à reconstituer la pleine complexité de la matrice extracellulaire, ou à des possibilités futures d’utilisation des fibres de collagène dans des bio-implants. De manière plus générale, notre système de fibres 3D pleinement contrôlées ouvrira la voie à de nombreuses applications futures dans les domaines du criblage de drogues ou du contrôle de la différenciation cellulaire.