Traitement de la myopathie à agrégats tubulaires et du syndrome de Stormorken par modulation d'ORAI1 – ODDYSY

Afin d’évaluer la capacité des shRNA et des ASO à empêcher le développement de la TAM/STRMK et à inverser les signes de la maladie, les souris ont été traitées soit avant l’apparition de la maladie à l’âge de 1 mois, soit après son apparition à l’âge de 4 mois. Les animaux ont reçu soit une injection unique de shRNA encapsulés dans un vecteur AAV, assurant un effet à long terme, soit des injections hebdomadaires d’ASO nus présentant différentes chimies (MOE et LNA), permettant une diminution transitoire et contrôlée de l’expression d’ORAI1.

Les souris traitées et non traitées ont fait l’objet de mesures régulières du poids corporel et de la force musculaire. Au bout de 12 semaines, les animaux ont été anesthésiés et le muscle tibial antérieur a été stimulé électriquement afin d’évaluer la force musculaire maximale, la contraction et la fatigabilité. Des coupes musculaires ont été analysées par microscopie, et nous avons également étudié l’effet des shRNAs et des ASOs sur l’expression des gènes musculaires. Afin de compléter les investigations musculaires, des échantillons de la rate ont été prélevés pour analyses de structure et composition, et des prélèvements sanguins ont été réalisés afin de déterminer le nombre et la taille des plaquettes. Pour approfondir l’étude du phénotype hémorragique de la TAM/STRMK, nous avons analysé la formation des plaquettes ainsi que la fonction des cellules productrices de plaquettes dans la rate et la moelle osseuse à l’aide de différentes techniques de routine.

Dans l’ensemble, la comparaison de la croissance, de la contraction musculaire, de la structure musculaire, de l’architecture splénique, de la formation des plaquettes et de leur fonction chez des souris TAM/STRMK traitées ou non, devrait permettre de :

- Mettre en évidence les mécanismes moléculaires à l’origine des troubles de croissance, de la faiblesse musculaire, du dysfonctionnement splénique et de la diathèse hémorragique observés dans la TAM/STRMK

- Évaluer l’efficacité thérapeutique des shRNA et des ASO

- Déterminer quelles voies moléculaires sont restaurées par le traitement.

Dans le modèle cellulaire, sh22, sh190, MOE10 et LNA4 ont été identifiés comme les shRNA et ASO les plus efficaces. Ces molécules ont été utilisées pour traiter les souris TAM/STRMK avant l’apparition de la maladie, à l’âge d’un mois.

Les souris TAM/STRMK ayant reçu sh190 présentaient une masse corporelle et une force musculaire supérieures aux souris non traitées, tandis que l’injection de sh22 s’est révélée moins efficace. Les injections hebdomadaires d’ASO n’ont eu aucun effet mesurable sur la masse corporelle, mais MOE10 et LNA4 ont tous deux permis de normaliser la force musculaire.

L’analyse de coupes musculaires par microscopie a révélé une atrophie de fibres musculaires chez les souris TAM/STRMK ainsi qu’une internalisation des noyaux, deux signes de dégénérescence musculaire. Chez les souris TAM/STRMK traitées par sh190 ou MOE10, le diamètre des myofibres ainsi que la proportion de fibres avec noyaux internalisés étaient revenus aux valeurs normales. sh22 et LNA4 étaient moins efficaces.

Afin de mieux comprendre les bases moléculaires du traitement, nous avons extrait l’ARN musculaire et analysé la transcription. Dans le muscle des souris TAM/STRMK, un grand nombre de gènes étaient dérégulés. Le traitement par sh190 ou MOE10 a conduit à une normalisation complète ou partielle de 28,9% et 22,9% des gènes dérégulés.

Nous avons également évalué le potentiel thérapeutique des traitements par shARN et ASO sur la rate et les plaquettes. Les souris TAM/STRMK présentent une splénomégalie, une composition splénique anormale ainsi qu’une diminution du nombre de plaquettes, entraînant des saignements prolongés. Les rates des souris TAM/STRMK traitées par sh190 étaient plus petites que celles des témoins, et l’examen morphologique a démontré une amélioration de leur structure. Les injections de sh22, MOE10 et LNA4 ont eu un impact plus limité.

Des investigations du phénotype hémorragique des souris TAM/STRMK ont révélé une diminution et un dysfonctionnement des plaquettes, entraînant une coagulation anormale. Les injections de MOE10 ont restauré la fonction plaquettaire sans augmenter le nombre de plaquettes et ont normalisé le temps de saignement des souris.

Dans l’ensemble, la diminution d’ORAI1 à l’aide de shRNA et d’ASO a permis de partiellement empêcher le développement de la TAM/STRMK chez la souris, avec des effets mesurables sur la croissance, le muscle, la rate, et les plaquettes. A noter qu’aucun des shRNA ou ASO n’a permis d’inverser les signes pathologiques après l’apparition de la maladie. En effet, les souris TAM/STRMK traitées à 4 mois par sh190, sh22, MOE10 ou LNA4 ne présentaient ni augmentation de la force musculaire, ni amélioration de la morphologie splénique, ni amplification du nombre de plaquettes. Ces résultats suggèrent qu’un traitement précoce par shARN ou ASO permet de prévenir le développement de la maladie, tandis que ces approches thérapeutiques deviennent inefficaces une fois la maladie installée.

Nous avons apporté la preuve expérimentale qu’une diminution du canal calcique ORAI1 par des shRNA ou des ASO permet de prévenir partiellement le développement de la TAM/STRMK dans un modèle animal. Ces résultats valident ORAI1 comme cible thérapeutique pour la TAM/STRMK et constituent une base solide pour le développement clinique de nouvelles approches thérapeutiques. Les shRNA et ASO ciblent des régions homologues d’ORAI1 chez l’homme et la souris, ce qui favorise leur transposabilité aux patients atteints de TAM/STRMK dans le cadre de futurs essais cliniques.

L’utilisation de vecteurs viraux transportant des shRNA soulève néanmoins des questions sur leur applicabilité et sécurité. Les personnes présentant une immunité préexistante contre les vecteurs viraux ne sont pas éligibles aux traitements fondés sur les AAV. Par ailleurs, les décès récents de patients atteints de myopathie myotubulaire (MTM) ou de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), attribués à une toxicité hépatique induite par les AAV, soulignent la nécessité d’améliorer la spécificité tissulaire de ces vecteurs afin de réduire le risque d’effets indésirables graves. Toutefois, la TAM/STRMK est une maladie multi-systémique qui nécessite une diffusion large du traitement dans l’ensemble des tissus affectés.

Les ASO surmontent certaines de ces limitations et représentent une alternative pertinente aux AAV. L’un des principaux avantages des ASO réside dans la flexibilité de leur administration, tant en termes de durée de traitement que de dosage, permettant une adaptation à l’évolution de la maladie ainsi qu’une réaction rapide en cas d’effets indésirables. Dans notre étude, les injections de MOE10 ont permis d’obtenir des améliorations significatives, et les ASO disposent d’un historique clinique établi dans le traitement de maladies génétiques. Néanmoins, ils peuvent induire des effets secondaires indésirables. En effet, plusieurs études ayant rapporté des toxicités hépatiques et rénales chez l’animal comme chez l’homme.

Dans l’ensemble, ces travaux ouvrent plusieurs perspectives de recherche. Il sera notamment important d’optimiser les modalités d’administration des ASO afin d’améliorer leur biodisponibilité dans les tissus cibles et d’augmenter leur efficacité thérapeutique. L’évaluation de schémas thérapeutiques plus précoces, de doses plus élevées ou de nouvelles générations d’ASO présentant des propriétés pharmacocinétiques améliorées pourrait permettre d’obtenir un bénéfice clinique plus important. Par ailleurs, le traitement par ASO pourrait être combinée à d’autres approches thérapeutiques ciblant des mécanismes physiopathologiques complémentaires. Enfin, la validation de ces résultats dans d’autres modèles animaux ainsi que l’évaluation approfondie de la tolérance à long terme constitueront des étapes essentielles avant une éventuelle translation clinique chez les patients atteints de TAM/STRMK.

La myopathie à agrégats tubulaires et le syndrome de Stormorken forment un spectre clinique caractérise par une faiblesse musculaire et des anomalies des os, de la peau, de la rate, et des plaquettes. TAM/STRMK est dû à des mutations de gain-de-fonction du senseur calcique STIM1 et du canal calcique ORAI1, qui suractivent le mécanisme ubiquitaire SOCE (store-operated Ca2+ entry) et induisent une entrée excessive de Ca2+. Notre équipe a identifié les causes génétiques et le pathomécanisme de TAM/STRMK, et nous avons généré un modèle souris portant la mutation la plus fréquente STIM1 R304W et reproduisant les signes majeures de la maladie humaine.
Il n’y a pas de traitement pour TAM/STRMK. Afin de déterminer le potentiel thérapeutique d’une modulation d’ORAI1, nous avons croisé nos souris Stim1R304W/+ avec des souris Orai1+/- exprimant 50 % d’ORAI1. Le phénotypage a démontré un ratio de natalité normalisé des souris Stim1R304W/+Orai1+/-, ainsi qu’une meilleure croissance, architecture osseuse, et fonction musculaire. Par ailleurs, nous avons produit des AAVs contenant des shRNA Orai1-specifiques, et l’injection intramusculaire de souris Stim1R304W/+ a amélioré la contraction musculaire.
Basé sur cette preuve de concept, nous voulons réduire l’expression d’Orai1 de manière systémique après naissance afin d’anticiper et de reverser le développement de la maladie. Nous allons injecter les shRNAs dans des nouveau-nés et souris adultes et évaluer la croissance, la structure osseuse, la force musculaire, l’histologie de la rate et de la peau, et la morphologie et fonction des mégacaryoctes et des plaquettes. Comme approche alternative de thérapie, nous allons injecter des ASOs (antisense oligonucleotides) ciblant ORAI1 dans les souris Stim1R304W/+. Dans l’ensemble, ce projet vise à démontrer l’effet bénéfique de la réduction de l’expression d’ORAI1 après naissance, et d’établir des shRNAs et ASOs Orai1-spécifiques pour des essais cliniques futurs.