Un nouveau mécanisme de contrôle posttraductionnel pour EXOSC10/Rrp6 – EXOPROT

Pour répondre aux questions présentées dans la section « Objectifs », nous avons utilisé les méthodes suivantes :

Objectif 1 : Des cellules de cancer du sein MCF7 ont été cultivées dans des conditions standards, puis les niveaux d’EXOSC10 ont été déterminés par Western blot lors d’une croissance optimale à 37 °C, après choc thermique à 42 °C, et en condition de restriction nutritionnelle (2 % vs 8 % de sérum de veau fœtal, SVF), à l’aide d’un anticorps anti-EXOSC10 commercial (Abcam). Nous avons ensuite étudié l’effet du 5-fluorouracile (5-FU) sur les partenaires d’interaction d’EXOSC10. Nous avons évalué si le 5-FU modifie les modifications post-traductionnelles d’EXOSC10 et altère son interactome via des effets transcriptionnels et traductionnels. Dans ce but, des cellules HEK293T ont été transfectées avec un plasmide commercial exprimant EXOSC10 sous le contrôle du promoteur CMV, fusionné à un tag C-terminal DDK/MYC (OriGene). Une co-immunoprécipitation sur billes magnétiques a permis de purifier EXOSC10 et ses cofacteurs, en utilisant des conditions de lavage à forte salinité/Tween-20. Les protéines éluées ont été analysées par spectrométrie de masse en collaboration avec la plateforme de protéomique de l’IGBMC (Luc Negroni et Bastien Morlet, Strasbourg). Les protéines dont l’interaction avec EXOSC10 est augmentée ou diminuée par le 5-FU ont été identifiées et intégrées à nos données de profilage transcriptomique obtenues dans des cellules MCF7 traitées ou non par 5-FU, afin de distinguer des variations dépendantes ou indépendantes de l’ARNm.

Objectif 2 : Bien que l’ARNm d’EXOSC10 présente une expression cyclique au cours du cycle cellulaire mitotique, des études protéomiques n’ont pas identifié EXOSC10 comme protéine régulée par le cycle. Nous avons testé l’hypothèse d’une régulation d’EXOSC10 par la voie APC/C-protéasome lors de la croissance normale et après stress thermique (42 °C), en combinant Western blot et déplétion par siRNA de la sous-unité essentielle CDC16. Les niveaux d’EXOSC10 ont également été mesurés en présence d’Apcin (inhibiteur de l’APC/C) et de MG132 (inhibiteur du protéasome).

Objectif 3 : Un allèle muté EXOSC10S402T a été généré par mutagenèse dirigée, modifiant une sérine hautement conservée au sein de l’unique boîte de destruction reconnue par l’APC/C, conservée de la levure à l’homme. La localisation subcellulaire et la stabilité d’EXOSC10S402 ont été analysées par immunocytochimie (anticorps anti-MYC) et Western blot à partir de cellules HEK293T transfectées.

Objectif 4 : Des cellules HEK293T exprimant EXOSC10 marqué ont été cultivées en présence ou en absence de 5-FU, puis la protéine a été purifiée par affinité. Quatre types de modifications post-traductionnelles (méthylation, acétylation, phosphorylation et ubiquitination) ont été identifiés par spectrométrie de masse. Les allèles mutants K583E et K583R ont été générés par mutagenèse dirigée.

Objectif 1 : stabilité d’EXOSC10 et interactions protéiques en conditions de stress.

Nous avons montré que le choc thermique (42 °C) diminue le niveau protéique d’EXOSC10 de manière indépendante du complexe APC/C, la déplétion de CDC16 par siRNA n’ayant aucun effet protecteur. Un stress nutritionnel (faible FCS) réduit également EXOSC10, selon un mécanisme encore indéterminé. L’analyse de l’interactome d’EXOSC10 marqué en présence ou en absence de 5-fluorouracile (5-FU, 50 µM) révèle un remodelage majeur des protéines co-purifiées. L’intégration de données transcriptomiques distingue des variations protéiques dépendantes de l’ARNm et d’autres indépendantes, suggérant que le 5-FU induit l’instabilité de certaines protéines ou empêche leur incorporation dans des complexes contenant EXOSC10.

Objectif 2 : régulation d’EXOSC10 par l’APC/C.

La déplétion de CDC16 ainsi que l’inhibition de l’APC/C et du protéasome n’affectent pas les niveaux d’EXOSC10. De plus, la mutation d’une sérine conservée dans la boîte de destruction n’altère ni la stabilité ni la localisation de la protéine. Bien que cette mutation provoque un arrêt embryonnaire chez la souris, comparable à une délétion génique, nos données indiquent que l’APC/C ne cible pas EXOSC10 humain lors de la croissance mitotique normale.

Objectif 3 : mutation d’une boîte de destruction conservée.

L’allèle EXOSC10S402T n’affecte ni la stabilité ni la localisation de la protéine, mais induit une létalité embryonnaire chez la souris. Ces résultats confirment que serine 402 localisée dans la boîte de destruction conservée n’est pas impliquée dans la régulation de la stabilité d’EXOSC10.

Objectif 4 : modifications post-traductionnelles d’EXOSC10.

Suite à la publication de Filippopoulou et al. (2024) montrant que K583 régule la localisation d’EXOSC10 par sumoylation plutôt que sa stabilité, nous avons recentré nos analyses sur l’impact du 5-FU sur les PTM et l’interactome d’EXOSC10. La spectrométrie de masse révèle des méthylations, acétylations, phosphorylations et ubiquitinations d’EXOSC10, ainsi que son association avec des sous-unités de l’exosome et des cofacteurs. L’interaction EXOSC10–cofacteur a été validée par Western blot. La déplétion de la cible diminue EXOSC10 sans affecter l’ARNm, suggérant un nouveau mécanisme de cytotoxicité du 5-FU impliquant une perturbation de l’interactome d’EXOSC10, en particulier de son interaction avec C1D.

1. Allèles LoF d’EXOSC10 et 5-FU.

Nos résultats identifient EXOSC10 comme un marqueur potentiel d’hypersensibilité au 5-fluorouracile (5-FU) chez les porteurs hétérozygotes d’allèles à perte de fonction (LoF) ainsi que dans les tumeurs présentant des mutations de novo. La sensibilité au 5-FU constitue un enjeu clinique majeur, et les marqueurs actuellement disponibles ne permettent pas d’expliquer l’ensemble des réponses observées. Par ailleurs, l’identification d’un allèle LoF d’EXOSC10 dans une tumeur pourrait permettre d’ajuster les doses de 5-FU afin d’obtenir une toxicité antitumorale suffisante tout en limitant certains effets indésirables.

2. Réseau d’interactions d’EXOSC10 et toxicité du 5-FU.

Au regard de nos résultats, il est probable que le 5-FU perturbe le vaste réseau d’interactions protéiques d’EXOSC10, à la fois aux niveaux transcriptionnel et post-traductionnel. L’effet négatif du 5-FU sur l’interaction C1D–EXOSC10, nécessaire au maintien de niveaux normaux d’EXOSC10 et à l’activité enzymatique de l’exosome nucléaire de l’ARN, constitue une piste mécanistique particulièrement intéressante.

3. Modifications post-traductionnelles (PTM) d’EXOSC10.

Nous avons identifié de nouvelles PTM susceptibles d’affecter la fonction de résidus d’acides aminés mutés dans des cancers somatiques. Ces données, fondées sur des analyses robustes de spectrométrie de masse, permettront d’évaluer si ces PTM influencent la croissance des cellules cancéreuses ou la résistance au 5-FU, notamment via le contrôle de l’activité et de la localisation d’EXOSC10.

4. Allèle EXOSC10S402T.

Des travaux complémentaires permettront d’élucider le défaut fonctionnel spécifique associé à l’allèle EXOSC10S402T, ainsi qu’aux allèles apparentés identifiés dans la base de données gnomAD, responsables d’un phénotype de létalité embryonnaire.

L'exoribonucléase 3'-5' conservée EXOSC10 (Rrp6 dans la levure) est essentielle pour l'embryogenèse, le développement du cerveau antérieur et des globules rouges, la gamétogenèse et la division des cellules cancéreuses. Parmi les substrats les mieux étudiés de la protéine figurent les ARN ribosomiques (ARNr) et les petits ARN nucléolaires (snoARN) importants pour la biogenèse des ribosomes, et les ARN longs non codants (lncARN) impliqués dans l'activité d'amplification des lymphocytes B et la réparation des cassures double brin (DSB). Notre objectif principal est de comprendre comment la stabilité de l'exoribonucléase humaine 3'-5' EXOSC10 est régulée, et si des signaux externes tels que le stress physique et chimique altèrent la biogenèse des ribosomes et l’élongation de la traduction en modifiant la concentration cellulaire de la protéine, donc son activité. Nous émettons l'hypothèse qu'EXOSC10 est ciblé par la voie du complexe promoteur d'anaphase/cyclosome (APC/C)-protéasome et constitue ainsi un lien moléculaire entre les signaux externes et les effets sur la biogenèse et la fonction des ribosomes. Notre modèle prédit que les allèles EXOSC10 dont la stabilité et/ou l'activité sont altérées peuvent être à l'origine de certaines ribosomopathies, définies comme des maladies causées par des composants ARN/protéines altérés des ribosomes ou des produits géniques nécessaires à la biogenèse des ribosomes. Étant donné que le médicament anticancéreux 5-fluorouracile (5-FU) réduit l'activité enzymatique d'EXOSC10 via l'inhibition du substrat, les allèles mutants présentant une stabilité accrue dans les cellules cancéreuses peuvent également contribuer à la survie des cellules cancéreuses et, finalement, à la résistance aux médicaments via un mécanisme compensatoire.
Nos principaux objectifs sont de (1) démontrer que la Rrp6 de la levure et l'EXOSC10 des mammifères sont régulés au niveau post-traductionnel par des effets environnementaux, (2) tester notre hypothèse selon laquelle la voie APC/C-protéasome joue un rôle critique et conservé au cours de l’évolution en contrôlant la stabilité d’EXOSC10/Rrp6, (3) déterminer si des allèles EXOSC10 anormalement stables altèrent la capacité d'une cellule cancéreuse à progresser dans le cycle cellulaire mitotique et à répondre au traitement médicamenteux, et (4) identifier les acides aminés dans EXOSC10 qui ont été mutés dans des cancers et analyser l'effet de ces mutations sur la division cellulaire et la résistance aux médicaments dans des cellules en culture.
Le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de régulation qui contrôlent la stabilité d'EXOSC10 et aidera ainsi à mieux comprendre comment le stress nutritionnel, physique et chimique influence la biogenèse des ribosomes et la traduction des protéines. Les résultats des travaux proposés ne sont donc pas seulement d'un intérêt pour la biologique cellulaire et développemental, mais permettront également à améliorer le pronostic des traitement médicamenteux et à élucider les mécanismes moléculaires liés aux ribosomopathies.