Vaccins liponanoparticulaires mARN et ADN pour les poissons, couplés à des adjuvants immunomodulateurs – LipoFishVac

|Les séquences d'ARNm codant pour les protéines virales pertinentes (c'est-à-dire les protéines G du SVCV et du VHSV) ont été optimisées. Après transcription in vitro, coiffage et double purification, les ARNm ont été formulés sur des LNP optimisées par une approche couche par couche et caractérisés à l'aide de tests standard. En parallèle, des immunomodulateurs ont été chargés sur des micelles : poly(I:C) (un ligand TLR3) ; Pam3CSK4, (un ligand TLR2) et 3M-052, (un ligand TLR7-8 par P4). Des micelles issues du copolymère à blocs PLA-b-poly(Nacryloxysuccinimide-co-N-vinylpyrrolidone) ont été préparées et la bioactivité des ligands chargés a été vérifiée par des tests in vitro à l'aide de lignées cellulaires rapporteuses. L'ADN codant pour l'Ag correspondant a été produit en parallèle et utilisé comme contrôle. La biotoxicité et la biodistribution de l'ARNm-LNP ont été évaluées in vitro dans des lignées cellulaires de poissons, puis in vivo. Des tests de toxicité aiguë sur les embryons de poisson (FET) ont été réalisés sur des larves de poisson zèbre en analysant : (1) la létalité embryonnaire par coagulation des œufs fécondés, l'absence de formation de somites, l'absence de détachement du bourgeon caudal du sac vitellin et l'absence de battements cardiaques et (2) les anomalies du développement. L'analyse de la biodistribution du LNP et la localisation des réponses innées induites (en particulier en fonction des différents adjuvants micellaires) ont été réalisées chez des larves de poissons zèbres : le LNP fluorescent sera administré à des lignées transgéniques de poissons zèbres rapporteurs dans lesquelles des types cellulaires spécifiques étaient fluorescents.

Outre la validation de la protection contre une infection virulente, la caractérisation des réponses immunitaires innées et adaptatives induites par les vaccins à ARN messager LNP a été réalisée en comparaison avec les vaccins à ADN correspondants, et la modulation par les micelles adjuvantes a été évaluée. Les réponses ont été étudiées à l'aide d'un suivi individuel basé sur des prélèvements sanguins réguliers, ce qui a considérablement accru la puissance des analyses. Les anticorps neutralisants sériques ont été quantifiés par un test de plaque. Des marqueurs sélectionnés dans les leucocytes sanguins (notamment CD4, CD8, IgM, IL1, TNF, IFN de type I, Mx) ont été déterminés par des tests QPCR. L'approche Random-tag 5'RACE a été utilisée pour amplifier et séquencer les domaines IgH V exprimés dans la rate et d'autres tissus des poissons exposés, et pour déterminer l'impact de la vaccination sur la structure des répertoires immunitaires.

|1- Preuve de concept de l'efficacité d'un vaccin ARNm contre une maladie virale chez un poisson.

Nous avons comparé différents systèmes d'administration d'ARNm pour l'expression invitro dnas des lignées cellulaires et in vivo chez les poissons. Nous avons développé une preuve de concept pour la vaccination à l'ARN chez la truite arc-en-ciel, un salmonidé, démontrant l'efficacité des systèmes actuels d'administration de vaccins chez les poissons.

Ayad C, et al. .Vaccine. 2025 Apr 19;53:126957. doi: 10.1016/j.vaccine.2025.126957.

2- Caractérisation de la composition de la réponse des cellules B des poissons à l'ARNm, à l'ADN et au vaccin vivant atténué

Nous avons comparé les réponses des cellules B induites par un ARNm, un ADN et un vaccin atténué, tous codant pour le même antigène contre un rhabdovirus du poisson. Les répertoires IgHμ de la truite arc-en-ciel ont été examinés afin d'étudier comment les vaccins remodèlent la composition clonale et la complexité du répertoire des cellules B. Le virus atténué a induit une protection grâce à un petit nombre de clonotypes publics hautement partagés codant pour des anticorps neutralisants. Les vaccins à ARNm ont profondément remodelé le répertoire chez certains individus et induit des titres d'anticorps neutralisants faibles, mais toujours protecteurs, sans expansion publique. Le vaccin à ADN a induit des titres d'anticorps neutralisants élevés, offrant une protection complète avec un impact minimal sur le répertoire des cellules B. Ces résultats soulignent les divergences profondes entre les réponses des cellules B des poissons aux vaccins à acide nucléique et aux vaccins atténués, alors que les trois vaccins induisent des réponses protectrices.

Porter D, et al. NPJ Vaccines. 2025 Jul 24;10(1):166. doi: 10.1038/s4154

3- Impact de la modification de l'ARNm sur la réponse innée au vaccin

Nous avons évalué les réponses immunitaires innées induites par quatre plateformes vaccinales : un vaccin à ADN, un virus vivant atténué de la septicémie hémorragique virale (VHSV), un ARNm non modifié et un ARNm modifié par N1MΨU. Les quatre vaccins codent pour la protéine G du VHSV (GVHSV) chez la truite arc-en-ciel. Après injection intramusculaire, les deux formats de vaccins à ARNm ont induit des réponses robustes de type I interféron (IFN), comparables à celles induites par les vaccins à ADN et à virus atténué. Il est à noter que le vaccin à ARNm modifié par N1MΨU n'a pas supprimé l'induction de l'IFN, comme observé dans les systèmes mammifères, mais a plutôt déclenché une dynamique transcriptionnelle temporelle distincte et un enrichissement plus important de l'autophagie, de l'ubiquitination et de la transcription.

Porter D, et al. Mol Ther Nucleic Acids. 2026 Feb 7;37(1):102862. doi: 10.1016/j.omtn.2

Des publications sur la biodistribution de l'ARNm-LNP et l'effet des adjuvants micellaires sont en préparation et seront soumises en 2026.

Ce projet ayant permis de produire un vaccin protecteur à ARNm pour les poissons, il sera important de concevoir des vaccins et des systèmes d'administration capables de s'adapter à différentes températures de l'eau. Deux défis principaux devront être relevés : (1) Les vaccins à ARNm et leurs adjuvants devront être optimisés pour exprimer l'antigène et assurer une co-stimulation efficace chez les espèces de poissons d'élevage ciblées, à différentes températures, alors que les systèmes disponibles ont été développés pour des mammifères dont la température corporelle est d'environ 37 °C. (2) Les mécanismes de l'effet de la température sur les réponses immunitaires des poissons restent mal compris. Le réchauffement climatique affecte les réponses immunitaires des poissons, car ceux-ci sont des ectothermes. Il favorise également l'expansion des agents pathogènes et renforce leur virulence. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes fondamentaux d'adaptation de l'immunité des poissons à la température, en particulier la coopération entre les cellules B et T et le recrutement clonal, afin d'ajuster les vecteurs des vaccins à ARNm et les protocoles de vaccination.|Ce projet ayant permis de produire un vaccin protecteur à ARNm pour les poissons, il sera important de concevoir des vaccins et des systèmes d' administration capables de s'adapter à différentes températures de l'eau. Deux défis principaux devront être relevés : (1) Les vaccins à ARNm et leurs adjuvants devront être optimisés pour exprimer l'antigène et assurer une co-stimulation efficace chez les espèces de poissons d'élevage ciblées, à différentes températures, alors que les systèmes disponibles ont été développés pour des mammifères dont la température corporelle est d'environ 37 °C. (2) Les mécanismes de l'effet de la température sur les réponses immunitaires des poissons restent mal compris. Le réchauffement climatique affecte les réponses immunitaires des poissons, car ceux-ci sont des ectothermes. Il favorise également l'expansion des agents pathogènes et renforce leur virulence. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes fondamentaux d'adaptation de l'immunité.

L'aquaculture est devenue essentielle pour la production alimentaire humaine, et connaît une croissance très rapide. Elle est menacée par de multiples maladies, notamment celles causées par des virus, pour lesquelles il n'existe aucun traitement économiquement viable. Le développement d’une aquaculture « durable » nécessite donc de nouveaux vaccins contre les maladies virales. Bien que les vaccins à ARN messager (ARNm) fassent depuis peu partie intégrante de l'arsenal vaccinal, ils en sont encore à leurs balbutiements chez les poissons. Nous venons d'obtenir un vaccin ARNm à LipoNanoParticules (LNP) contre un virus de la carpe, basé sur les résultats de notre précédent financement ANR, FishRNAvax. Ce vaccin induit une protection efficace avec une relativement faible dose d'ARNm. Pour optimiser ce premier candidat vaccin à ARNm, nous proposons de comprendre les mécanismes impliqués car les modes d'action des vaccins à ARNm restent mal connus. Dans ce but, nous nous concentrerons sur deux maladies des poissons, respectivement causées par le virus de la septicémie hémorragique virale - VHSV - chez la truite, et par le virus de la virémie printanière de la carpe - SVCV - chez la carpe. Ces deux modèles correspondent à des maladies à déclaration obligatoire et ciblent des espèces représentatives des deux principaux groupes de poissons d'élevage, les cyprinidés et les salmonidés. Ces modèles permettent aussi la comparaison avec des vaccins à ADN existants exprimant les mêmes antigènes, qui induisent une protection élevée et des anticorps neutralisants. Le projet vise à caractériser les réponses immunitaires, innées et adaptatives, en recherchant les corrélats de la protection induite par les vaccins LNP-ARNm chez la carpe et la truite, afin d'optimiser la formulation des vaccins ARNm avec une faible quantité d'ARNm. Nous analyserons la biodistribution de l'ARNm LNP après vaccination, et sa modulation par trois immunostimulants agissant comme adjuvants. En effet, nous faisons l’hypothèse que la co-administration de LNP mRNA avec des micelles apportant des agonistes de TLR augmentera la qualité et l'intensité des réponses, et améliorera leur localisation muqueuse. Nous caractériserons l'effet de l'induction de l'IFN de type I au site d'injection, car il augmente considérablement l'intensité de la réponse au vaccin ADN chez le saumon, et la protection. Nous étudierons également la structure des réponses cellulaires B/T induites par les vaccins ARNm LNP ou par un challenge des poissons vaccinés, par séquençage du répertoire Ig/TCR. Sur la base de nos travaux antérieurs, nous déterminerons la fréquence des composants publics (présents chez tous les individus) des réponses induites par les vaccins à ARNm LNP, en comparaison avec un vaccin vivant atténué. Le consortium réunit quatre partenaires ayant une expertise complémentaire en chimie, immunologie moléculaire des poissons et vaccinologie, afin d'optimiser la nanoformulation des vaccins ARNm LNP et d'explorer les particularités des réponses des poissons à ces vaccins innovants. Le développement récent de vaccins ARNm contre le COVID19 a mis en évidence le manque de connaissances sur les caractéristiques de ces vaccins, en termes de qualité et de durée, ainsi que sur leur biodistribution, et l'importance des doses d’ARN. Outre le développement de candidats vaccins ARNm optimisés pour la carpe et la truite, ce projet fournira des connaissances de base sur les mécanismes immunitaires des réponses induites par les vaccins ARNm de poisson lorsqu'ils sont conditionnés dans une plateforme nanocarrier biodégradable. En outre, il explorera i) l'importance des doses d'ARNm pour assurer la protection ii) l'importance de la co-administration d'immunomodulateurs (ligands TLR) pour augmenter l'immunité durable et les réponses immunitaires muqueuses. Ces connaissances seront utiles pour guider les développements futurs et la conception de la prochaine génération de vaccins à ARNm pour les poissons.