Immunité basée sur l'ARN contre les flavivirus chez les arthropodes et cellules de mammifères – RIFLAVIRAM

Le projet RIFLAVIRAM combine la virologie moléculaire, la protéomique, la biologie de l’ARN, le séquençage et les analyses computationnelles afin d’étudier la manière dont l’ARN des flavivirus neurotropes interagit avec les facteurs de l’hôte et s’adapte au passage entre différents hôtes.

Au cours du projet, les stratégies expérimentales et les modèles d’infection ont été adaptés, de nouveaux outils ont été développés et des approches récentes d’analyse de la structure de l’ARN ont été mises en œuvre dans des systèmes mammifères et vecteurs pertinents. Afin d’identifier les protéines de l’hôte interagissant avec l’ARN viral, nous avons optimisé une purification par affinité centrée sur l’ARN couplée à la spectrométrie de masse (ChIRP-MS), en utilisant les ARN génomiques et sous-génomiques du virus de l’encéphalite à tiques (TBEV) comme appâts. Cette approche a été adaptée à des lignées cellulaires humaines ainsi qu’à du matériel de tiques entières.

Les données de spectrométrie de masse ont été analysées à l’aide d’un pipeline dédié combinant des statistiques de fold-change et un score MiST, puis intégrées à des jeux de données publics (profils d’expression génique, données CLIP publiées et interactions connues avec les flavivirus) afin de prioriser les candidats. Pour évaluer la pertinence fonctionnelle des facteurs de l’hôte identifiés, nous avons développé des virus TBEV recombinants par réaction d’extension circulaire de polymérase (CPER). Deux virus rapporteurs ont été générés : un virus exprimant la GFP, optimisé pour l’imagerie à haut contenu, et un virus exprimant NanoLuc, optimisé pour des tests quantitatifs sur lecteur de plaques. Ces outils ont permis un criblage fonctionnel systématique d’environ 250 gènes de l’hôte sélectionnés, à l’aide d’approches basées sur les siRNA.

En parallèle, nous avons étudié la structure et l’adaptation de l’ARN viral. La structure de l’ARN complet du TBEV a été cartographiée par nano-DMS-MaP, combinant un marquage chimique et le séquençage par nanopores, dans des particules virales, trois types de cellules humaines et des cultures de tissus de tiques métaboliquement actives. L’adaptation virale a été étudiée par passages sériels du TBEV dans des lignées cellulaires humaines et chez la tique, suivis d’un séquençage par nanopores afin d’identifier des mutations, des haplotypes et des signatures de pressions sélectives spécifiques de l’hôte. Enfin, des prédictions in silico des interactions ARN-protéines ont été réalisées à l’aide de GraphProt et de jeux de données CLIP publics, permettant d’intégrer les données d’interactome, de structure et d’adaptation dans des modèles mécanistiques testables.

Le projet RIFLAVIRAM a généré un ensemble de données complet et multi-niveaux décrivant les interactions entre l’ARN des flavivirus et les facteurs de l’hôte dans des systèmes mammifères et chez la tique. Bien que la proposition initiale incluait à la fois le virus Zika (ZIKV) et le virus de l’encéphalite à tiques (TBEV) comme flavivirus modèles, les analyses expérimentales ont révélé que la réplication du ZIKV n’était pas suffisamment robuste dans les modèles humains et arthropodes sélectionnés pour permettre des analyses aval reproductibles. En revanche, le TBEV s’est répliqué de manière efficace et reproductible dans des types cellulaires humains pertinents ainsi que dans des modèles de tiques. Le projet s’est donc concentré sur le TBEV en tant que modèle biologiquement et techniquement maîtrisable, tout en restant pleinement aligné avec les objectifs initiaux.

En utilisant une purification par affinité centrée sur l’ARN couplée à la spectrométrie de masse (ChIRP-MS), nous avons identifié l’interactome étendu des ARN génomiques et sous-génomiques du TBEV dans deux modèles de cellules immunitaires humaines : une lignée monocytique et une lignée microgliale. Plusieurs milliers de protéines de l’hôte ont été détectées, dont une fraction importante était commune aux différentes espèces d’ARN et aux deux types cellulaires, tandis que d’autres présentaient une forte spécificité de type cellulaire. La quantité limitée de matériel biologique et des contraintes techniques n’ont pas permis de générer des jeux de données d’interactome concluants à partir de cellules neuronales ni chez la tique.

Sur la base du classement des interactomes, environ 250 facteurs de l’hôte ont été sélectionnés pour des analyses fonctionnelles. Afin de permettre une validation systématique, deux virus rapporteurs TBEV recombinants ont été générés et caractérisés. Un virus rapporteur GFP a permis des criblages basés sur l’imagerie à haut contenu, tandis qu’un virus rapporteur NanoLuc a permis une mesure sensible et quantitative de la réplication virale. Le criblage fonctionnel a permis d’identifier des facteurs de l’hôte à effet proviral ou antiviral, et de prioriser des candidats pour des études mécanistiques ultérieures.

En parallèle, la structure et l’adaptation de l’ARN viral ont été analysées. La structure de l’ARN génomique complet du TBEV a été cartographiée par nano-DMS-MaP dans des particules virales, trois types cellulaires humains et des tissus de tiques. Les analyses comparatives ont révélé des caractéristiques structurales de l’ARN spécifiques de l’hôte et de l’espèce, particulièrement enrichies dans la région non traduite 3′, en accord avec un rôle régulateur dans les interactions avec l’hôte partagé par de nombreux arbovirus. Des expériences de passages sériels dans des cellules humaines et chez la tique ont mis en évidence une adaptation virale dépendante du contexte, avec une augmentation des titres viraux dans certains modèles et l’émergence de mutations no

Les travaux futurs se concentreront sur l’achèvement de l’intégration des données d’interactome ARN, de criblage fonctionnel, de structure de l’ARN et d’adaptation virale, afin de générer des modèles hiérarchisés et testables des interactions entre l’ARN du TBEV et l’hôte. Les candidats prioritaires seront validés à l’aide d’immunoprécipitations ciblées d’ARN, d’analyses mutationnelles et de tests basés sur des systèmes rapporteurs.

L’extension des analyses à des cellules humaines primaires, à des modèles neuronaux supplémentaires et à des organes de tiques disséqués renforcera la pertinence biologique des résultats. Une augmentation de la profondeur de séquençage permettra une analyse plus fine de la dynamique des populations virales et des pressions sélectives. Au-delà du TBEV, le cadre conceptuel et méthodologique développé dans le projet RIFLAVIRAM pourra être appliqué à d’autres virus à ARN transmis par les arthropodes. Les systèmes rapporteurs recombinants, les workflows de protéomique centrés sur l’ARN et les pipelines d’analyse intégrative constituent une base solide pour de futurs projets et pour une exploitation collaborative par l’ensemble des communautés de la virologie et de la biologie de l’ARN.

Parce qu’ils dépendent de leur hôte pour se répliquer, les virus doivent faire face à de nombreux mécanismes de défense basés sur la reconnaissance de leur génome. Cela résulte en une course à l’armement dans laquelle le pathogène et son hôte co-évoluent pour échapper et renforcer la détection et l’élimination par le système immunitaire. Néanmoins, cette stricte dépendance vis-à-vis d'un organisme hôte les rend également vulnérables, en particulier dans les premières étapes de l'infection, car ils doivent exposer leur génome dans les cellules qu'ils infectent. Pour cette raison, la détection des acides nucléiques étrangers représente une caractéristique commune de la défense antivirale au cours de l'évolution. Les travaux des trente dernières années ont révélé que les acides nucléiques viraux, et en particulier l'ARN, sont des molécules importantes pouvant être détectées par les récepteurs cytosoliques. Parmi les principaux signaux de danger sont les longs ARN double brins (db), générés lors de la réplication virale ou par transcription convergente. En conséquence, tous les eucaryotes ont développé une réponse immunitaire innée basée sur des récepteurs détectant les ARNdb.
Dans ce projet, nous étudierons les réponses cellulaires aux virus transmis à l'homme par les arthropodes pour identifier et caractériser les complexes impliqués dans la détection des acides nucléiques viraux, et plus particulièrement l'ARNdb. Nous étudierons des virus de la famille des Flaviviridae transmis par les moustiques ou les tiques. Plus spécifiquement nous nous focaliserons sur le virus de Zika (ZIKV) et le virus de l’encéphalite à tique (TBEV). Ces virus seront étudiés à la fois dans des cellules humaines et dans des systèmes arthropodes tels que des cellules de moustiques et de tique. Nous travaillerons également au niveau d’organismes entiers en utilisant le modèle génétiquement compatible de la drosophile, les moustiques et les tiques. Parce que les arbovirus doivent faire face à différents mécanismes de défense en fonction de l'hôte qu'ils infectent, ils offrent une opportunité unique de comprendre avec précision les facteurs impliqués dans l'immunité innée basée sur la détection de l’ARNdb au cours du cycle viral. Le but de ce projet est d'étudier les infections virales dans trois organismes (humain, moustique, tique) pour comprendre le système immunitaire inné antiviral en (i) identifiant les protéines impliquées dans la reconnaissance et la détection des ARNdb; (ii) déterminer parmi ces protéines celles jouant un rôle pro ou antiviral et (iii) disséquer le mode d'action moléculaire et cellulaire des facteurs les plus prometteurs. Nos résultats fourniront à la communauté une vue détaillée des mécanismes utilisés par les cellules humaines ou les arthropodes pour discriminer entre les ARN du soi et ceux du non-soi et pourraient ouvrir la voie à la conception de nouvelles approches thérapeutiques.
Les trois laboratoires impliqués dans ce projet ont des compétences complémentaires allant de la virologie, l’entomologie, la biochimie, la biologie de l’ARN, la protéomique à la génétique. Nous avons déjà généré un grand nombre de données préliminaires et pouvons commencer à étudier la fonction des protéines déjà identifiées. Nous avons une preuve de principe solide que l'ARNdb viral est détecté par des protéines spécifiques dans les cellules hôtes. La puissance du criblage dans les cellules nous permettra d'évaluer l'importance de chacun des candidats lors d'une infection virale. La génétique chez la drosophile permet d’évaluer rapidement l’implication de ces protéines au niveau d'un organisme. Ce projet fournira une vue intégrée de la reconnaissance des virus capables d'infecter à la fois les arthropodes et les mammifères. Il intéressera un large public et s'avérera certainement utile pour lutter contre les virus posant des problèmes de santé au niveau mondial.