Mécanismes de toxicité induits par les métaux environnementaux sur le cytosquelette synaptique : de l'imagerie à super-résolution à l'identification moléculaire – SuperResMetalToxSyn

Ce projet interdisciplinaire a grandement bénéficié de la complémentarité des trois équipes de recherche et de l’accès à un parc instrumental exceptionnel : nano-imagerie des métaux par XRF (fluorescence X) au synchrotron, associée à la cryo-microscopie de fluorescence des protéines, et aux analysex par ESI-MS (spectrométrie de masse par ionisation par électrospray) en condition native de la liaison des métaux aux protéines.

Le projet s'est également appuyé sur un éventail de méthodes expérimentales telles que l'ICP-AES (Inductively Coupled Plasma Atomic emission Spectrometry) pour l'étude préalable de la solubilité des métaux dans le milieu de culture; l'immunofluorescence quantitative des protéines du cytosquelette dans les neurones primaires en culture; l'imagerie corrélative métaux-protéines et l'ESI-MS préalablement citées.

Nous avons dans un premier temps évalué la cytotoxicité des éléments métalliques pour définir des concentrations d’expositions sub-cytotoxiques ( As > Pb > Hg > Zn > Cu > Mn. Puis en utilisant l’immunofluorescence quantitative de la tubuline et de l’actine-F, nous avons montré que les contaminants métalliques présents dans l’environnement (Hg, As, Cd) induisent une organisation aberrante du cytosquelette dendritique en formant des dystrophies neuritiques, notamment des perles de tubuline. Les métaux physiologiques tels que le cuivre ou le zinc n’ont pas induit de formation de perles de tubuline à des concentrations < IC10.

Nous avons étudié l'accumulation de manganèse dans les neurones et les astrocytes primaires de l'hippocampe de rat à l'aide d'une approche d'imagerie corrélative combinant la microscopie optique à cryofluorescence et l'imagerie par fluorescence X synchrotron afin de cartographier et de quantifier le manganèse à une résolution subcellulaire. Le manganèse s'est accumulé de manière préférentielle dans l'appareil de Golgi, dans les neurones et les astrocytes. Dans les neurones, il était également présent au niveau de la densité postsynaptique, ce qui suggère un rôle dans la vulnérabilité synaptique. Puis, des études similaires ont été réalisées pour les autres métaux montrant la présence de ces métaux co-localisés avec des dystrophies neuritiques (perles de tubuline). Les expériences ESI-MS ont révélé l’interaction des métaux avec l’actine, une protéine impliquée dans le cytosquelette synaptique. Enfin nous avons montré que le Zn appliqué en co-exposition avec les métaux toxiques permet une protection complète contre l’induction de dystrophies neuritiques . Cet effet protecteur n’est pas observé dans le cas du cuivre, un autre métal physiologique. Ce résultat indique deux mécanismes majeurs au cœur de nos hypothèses de départ ; 1) les métaux toxiques induisent des effets sur le cytosquelette dendritique des neurones par interaction avec les sites de fixation du zinc et 2) les effets neurotoxiques des métaux environnementaux peuvent être inhibés par administration de zinc.

Les perspectives de ce projet sont nombreuses, en particulier nous avons montré le lien entre une exposition à des concentration subcytotoxiques de métaux environnementaux et des modifications du cytosquelette synaptique et dendritique des neurones de l’hippocampe suggérant un rôle direct des métaux dans la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer. Le projet a également permis de classer les métaux en fonction de leur neurotoxicité sur le cytosquelette avec Cd>As>Hg>Pb>Mn ce qui permet de fixer des priorités sur les futures recherches à mener. Ces travaux doivent être poursuivis en particulier pour déterminer la spécificité des interactions par exemple déterminer si les métaux interagissent avec d’autres protéines du cytosquelette (associées à la tubuline ou à l’actine) et si ces interactions sont directes ou provoquées par d’autres effecteurs comme le stress oxydant. Les mécanismes précis pourvoyant l’effet protecteur du zinc restent à élucider y-a-t-il compétition directe pour les sites de liaison des métaux aux biomolécules ou bien activation de voies de protection par synthèse de molécules complexant les métaux et dans ce cas lesquelles. Cette identification ouvrirait la voie vers des stratégies ciblées de neuroprotection.

En cours.

L'exposition environnementale aux métaux neurotoxiques est un problème de santé mondial qui touche des millions de personnes. Quatre métaux (arsenic, plomb, mercure et cadmium) figurent sur la liste des dix substances chimiques les plus préoccupantes pour la santé publique établie par l'Organisation Mondiale pour la Santé. Le manganèse et l'uranium sont deux autres éléments de plus en plus inquiétants. Ils provoquent tous des effets neurotoxiques. Des travaux de recherche récents ont mis l'accent sur les conséquences d'expositions prolongées à de faibles niveaux de contaminants sur de larges populations. Il est de plus en plus reconnu que l'apparition et la progression de nombreuses maladies neurologiques liées à l'âge, y compris la maladie d'Alzheimer, seraient déclenchée et/ou accélérée par l'exposition environnementale aux contaminants métalliques. Une solution pour faire face à ce problème mondial est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la neurotoxicité des métaux environnementaux et de concevoir des stratégies de prévention ciblées. Cependant, malgré des décennies de recherche, les mécanismes moléculaires impliqués dans les maladies neurodégénératives restent mal compris.
Nous proposons d'évaluer un nouveau mécanisme de neurotoxicité, basé sur l'interaction directe des métaux avec l'architecture du cytosquelette synaptique et se produisant à des concentrations environnementales. Une telle interaction provoquerait la désorganisation de la structure synaptique, peut-être par compétition avec les sites de liaison essentiels des métaux, ce qui entraînerait des déficiences synaptiques et des dysfonctionnements neurologiques. Nous caractériserons aux niveaux cellulaire et moléculaire les interactions de métaux neurotoxiques environnementaux connus (arsenic, cadmium, plomb, manganèse, mercure, uranium) avec les protéines du cytosquelette synaptique (tubuline, actine), et évaluerons les stratégies de prévention impliquant des éléments essentiels (cuivre et zinc).
Cette étude interdisciplinaire bénéficiera de la complémentarité de 3 équipes de recherche expertes en : neurotoxicologie des métaux (CENBG), neurobiologie des synapses (IINS), interactions métal-protéine (BIAM) ; et de l'accès à une instrumentation exceptionnelle : nano-imagerie synchrotron XRF (X-ray fluorescence) des métaux corrélée à la microscopie à super-résolution STED (stimulated emission depletion) des protéines, analyse native ESI-MS (electrospray ionization mass spectrometry) de la liaison des métaux aux protéines. Des neurones primaires d'hippocampe de rat seront utilisés comme modèle expérimental.
Le projet a 4 objectifs :
- L'évaluation de la toxicité synaptique des métaux environnementaux ;
- La nano-imagerie corrélative des métaux et des protéines du cytosquelette dans les compartiments synaptiques ;
- La caractérisation moléculaire de la liaison des métaux aux protéines du cytosquelette ;
- L'évaluation des effets protecteurs des métaux essentiels contre la toxicité synaptique.
Notre projet s'applique préférentiellement à l'étiologie de la maladie d'Alzheimer en raison du modèle cellulaire expérimental choisi, les neurones hippocampiques, mais les mécanismes suggérés sont susceptibles d'être impliqués dans d'autres neuro-pathologies tel que l'autisme, en fonction de la période d'exposition au cours de la vie. Nous espérons montrer pour la toute première fois la présence de métaux environnementaux dans les synapses et décrire l'altération consécutive des structures synaptiques. Ces résultats marquants contribueront à attirer l'attention de la communauté scientifique, des autorités publiques et des citoyens sur ces dangers environnementaux. La comparaison de différents métaux devrait aider à prioriser les interventions préventives et réglementaires.