Signaling des recepteurs nucleaires et perturbation endocrinien chez un mollusque : la puissance de l’approche functionelle – MusMod4EDC

Pour atteindre ces objectifs, le programme de travail est subdivisé en quatre tâches distinctes, mais interconnectées : - Tâche 1 : Cartographie spatio-temporelle précise de l'expression des récepteurs nucléaires dans les embryons de moules par une approche RNA-seq, qPCR, immunocytochimie et marquages in situ par « hybridization chain reaction ». - Tâche 2 : Caractérisation des phénotypes induits par l'exposition aux perturbateurs endocriniens. - Tâche 3 : Identification des gènes cibles des récepteurs nucleaires par une analyse RNA-seq différentielle suivie d’une analyse fonctionnelle in cellulo. - Tâche 4 : Évaluation des fonctions développementales des récepteurs nucléaires et de leur implication dans la réponse aux perturbateur endocriniens.

Tache 1 : L’analyse des 58 récepteurs nucléaires (46 séquences complètes et 12 séquences partielles) identifiés dans le génome de M. galloprovincialis par RNA-seq, hybridation in situ fluorescente et qPCR a été réalisée par les partenaires 1 (Dumollard) et 2 (Schubert) et publiée dans la revue Phil. Trans. B (doi:10.1098/rstb/379/1898). De plus, les partenaires 1 et 2 ont réalisé le transcriptome développemental complet de M. galloprovincialis (entre 0 et 72 heures après la fécondation) et des protocoles d’immunocytochimie couplés à des marquages in situ fluorescents multiplexés ont été développés qui permettent une analyse détaillée de l’ontogénie des différents tissus embryonnaires de la moule. Ce transcriptome et ces nouveaux protocoles ont été publiés dans la revue Development (doi:10.1242/dev.202256). Cette tâche est maintenant terminée. Tache 2 : Les cultures larvaires de moule en présence du perturbateur endocrinien TBT et les extractions d’ARNs/ADNs ont été réalisées. Nous avons établi que le TBT affecte le développement de la coquille larvaire ainsi que le développement neural et musculaire. Ces effets du TBT peuvent être prévenus par l’inhibition préalable du récepteur nucléaire RXR, suggérant que RXR est le principal médiateur des effets délétères du TBT sur la larve de moule. Nous prévoyons le séquençage en RNA-seq et ATAC-seq des embryons cultivés en présence de TBT (avec ou sans inhibiteur de RXR) pour le printemps 2024. Cette analyse nous permettra de trouver les réseaux de gènes affectés par le TBT qui dépendent de l’activité de RXR. Tache 3 : Les phénotypes induits par l’agoniste de RXR appelé 9 cis-retinoic acid (9cisRA) ont été caractérisés. Ces phénotypes ressemblent beaucoup aux phénotypes induits par TBT et sont sauvés par l’inhibition préalable de RXR, montrant encore une fois que le TBT exerce son action délétère sur les embryons de moules en activant RXR. De plus, des tests in cellulo permettant d’établir les capacités de liaisons des récepteurs nucléaires ont été effectués par le post-doc ANR du partenaire 1 (Miglioli, labo Dumollard) dans le laboratoire du partenaire 3 (labo Santos) lors d’une mission de 3 mois (été 2023). Ces analyses ont permis de démontrer que le 9cisRA et le TBT peuvent lier directement le récepteur RXR. De plus, huit autres récepteurs nucléaires ont été criblés pour la liaison à TBT et 9cisRA, et nous avons trouvé que, alors que le 9cisRA ne peut lier que RXR à des doses physiologiques, des doses environnementales de TBT peuvent activer les récepteurs RXR et NR4A (HR38). Nous avons donc identifié une nouvelle cible du TBT (NR4A) dans la moule qui pourrait aussi participer au mode d’action toxique de ce perturbateur endocrinien dans cet organisme invertébré marin.

Tache 1: Nous avons établi le premier transcriptome développemental complet de la moule méditerranéenne (M. galloprovincialis) (publié dans Development, doi:10.1242/dev.202256). De plus, nous avons établi la cartographie complète de l’expression développementale des récepteurs nucléaires au cours du développement de la moule méditerranéenne (M. galloprovincialis) (Phil. Trans. B, doi:10.1098/rstb/379/1898). Tache 2: Nous avons établi que le TBT affecte le développement de la moule en liant le récepteur nucléaire RXR (publication en préparation). Tache 4 : Nous allons commencer cette tache lors de l’hiver 2024 en mettant au point les techniques de transgénèse dans la moule. Cette tache nécessite aussi la finalisation de la tache 2 pour trouver des gènes cibles de récepteurs nucléaires et de cloner les régions régulatrices de ces gènes cibles.

1. Miglioli A, Tredez M, Boosten M, Sant C, Carvalho JE, Dru P, Canesi L, Schubert M, Dumollard R (2024) The Mediterranean mussel, Mytilus galloprovincialis, a novel model for developmental studies in mollusks. Development doi: 10.1242/dev.202256.
2. Miglioli A, Fonseca A, Besnardeau L, Canesi L, Schubert M, Dumollard R (2024) First characterization of the nuclear receptor superfamily in the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis: developmental expression dynamics and potential susceptibility to environmental chemicals. Philosophical Transactions of the Royal Society B doi: 10.1098/rstb/379/1898

3. Dumollard R, Miglioli A (2023) Toxicologie développementale sur les larves de moules : apport des méthodes d’immunohistochimie, d’hybridation in situ et d’imagerie pour l’étude fine des tissus, Revue Française d'Histotechnologie 35, 45-72.

La pollution aux perturbateurs endocriniens (PEs) est à la fois un défi de santé et une menace pour la biodiversité. De nombreuses pathologies déclenchées par l'exposition aux PEs à différents stades de la vie sont découvertes régulièrement. En revanche, mis à part les insectes, pratiquement rien n'est connu sur la toxicité des PEs chez les invertébrés. Les PEs se trouvant dans les plastiques, les produits de soins personnels et les produits industriels, de grandes quantités sont rejetées dans l'océan par les débouchés fluviaux et l'afflux d'eaux usées, ce qui fait de la pollution par les PEs un problème croissant pour l’environnement marin. Parmi les invertébrés, les mollusques sont particulièrement sensibles aux PEs, avec des cas d'hermaphrodisme induit par les PEs chez les gastéropodes (appelé imposex) et les bivalves (appelé intersexe). L'impact des PEs est abordé dans des études d'écotoxicologie qui reposent sur des dosages physiologiques ou biochimiques, mais pas sur des expériences fonctionnelles in vivo, ce qui a empêché jusqu'à présent l'identification des modes d'action moléculaires des PEs chez les invertébrés marins. Il y a donc actuellement d'énormes lacunes dans nos connaissances sur la toxicologie des PEs chez les invertébrés marins.
Les récepteurs nucléaires (NR) sont des facteurs de transcription activés par des ligands qui sont essentiels pour le système endocrinien des vertébrés. Leur dérégulation, par liaison de PEs, est l'une des principales causes de perturbation endocrinienne chez les vertébrés. Compte tenu de l'importance de la signalisation NR dans le système endocrinien des vertébrés, plusieurs tests standardisés utilisés pour détecter les PEs sont basés sur la mesure de l'activité NR. Cependant, chez les invertébrés, on ne sait pratiquement rien de la fonction des NRs ni de leurs roles dans la toxicité aux PEs. Ce qui a été montré, c'est que la présence d'un homologue de NR vertébré chez un invertébré n'est pas synonyme de la présence d'un système de signalisation identique de ce NR invertébré. Nous manquons donc actuellement d'une compréhension de base des rôles des NRs dans la perturbation endocrinienne les invertébrés.
Ce projet remédiera à cette lacune en établissant les embryons planctoniques de la moule M. galloprovincialis comme système modèle pour étudier les fonctions des NR et du rôle qu'ils jouent dans la toxicité aux PEs. Plus précisément, nous proposons de tester l'hypothèse que la signalisation NR est au centre des effets induits par les PEs pendant le développement de la moule.
Le projet est divisé en quatre tâches qui (1) fourniront des informations détaillées sur l'expression des NRs pendant le développement des moules, (2) compileront les effets des PEs sur les embryons de moule pour donner une liste de marqueurs moléculaires de la réponse aux PEs chez la moule, (3) détermineront comment les gènes affectés par les traitements aux PEs sont régulés par les NRs et (4) établiront les rôles joués par les NRs pendant le développement de la moules ainsi que leur contribution à la perturbation endocrinienne. Dans l'ensemble, en créant de nouvelles techniques et ressources pour M. galloprovincialis, le travail proposé sera le premier à définir les fonctions et les activités NRs pendant le développement des moules et à démontrer, in vivo, comment les PEs modifient ces fonctions, établissant ainsi les embryons planctoniques de M. galloprovincialis comme système d'étude puissant reliant la biologie du développement et l'écotoxicologie fonctionnelle. Les marqueurs moléculaires de la réponse aux PEs que nous identifierons au cours de ce projet seront extrêmement utiles pour les programmes de surveillance marine et les enquêtes écotoxicologiques de détections des PEs. Étant donné que la moule est une espèce sentinelle utilisée dans le monde entier pour étudier les milieux marins, les programmes internationaux de surveillance, comme Mussel Watch, bénéficieront donc grandement de ce projet.