Caractérisation par MS structurale de l’impact des protéoformes sur la conformation des anticorps monoclonaux thérapeutiques – conformAbs

Développement de stratégies de spectrométrie de masse top-down et middle-down (TD/MD-MS) pour décrypter le paysage des protéoformes des protéines thérapeutiques dérivées des anticorps monoclonaux.

Développement de stratégiesanalytiques basées sur la mobilité ionique au niveau top- et middle-level, sous conditions natives (nIM-MS), afin de décrypter le paysage conformationnel des protéines thérapeutiques dérivées des anticorps monoclonaux.

Développement d'une méthodologie intégrée combinant la spectrométrie de masse top-down et middle-down (TD/MD-MS) avec des approches de mobilité ionique (IM-MS) sous conditions non dénaturantes afin d'élucider directement l'influence des modifications de la séquence primaire et des modifications post-traductionnelles (PTMs) sur la structure d'ordre supérieur (HOS) des protéines thérapeutiques dérivées des anticorps monoclonaux.

Les analyses développées dans le cadre du projet conformAb ont ouvert de nouvelles perspectives pour la caractérisation des protéines thérapeutiques dérivées des anticorps monoclonaux (mAbs). L'identification et la localisation des modifications et des conjugaisons des protéines thérapeutiques ont été rendues possibles grâce au développement de stratégies de spectrométrie de masse top-down et middle-down (TD/MD-MS), offrant un débit analytique relativement élevé tout en nécessitant de faibles quantités d'échantillon. Les résultats obtenus dans le cadre du projet ont démontré un fort potentiel pour la caractérisation des protéines avec des modifications multiples, non seulement sur les protéines thérapeutiques, mais également sur d'autres systèmes biologiques complexes.

Par ailleurs, le développement d'approches de type collision induced unfolding (CIU) combinées à des méthodes de chromatographie liquide sous conditions non dénaturantes, ouvre de nouvelles perspectives pour étudier l'impact des modifications des protéines thérapeutiques sur leur structure d'ordre supérieur. Ces approches contribueront à une meilleure compréhension de la relation entre la structure et la fonction de ces biomolécules, favorisant ainsi l'optimisation de la découverte, du développement et de la caractérisation des protéines thérapeutiques.

Afin d'étendre les développements en spectrométrie de masse top-down (TD-MS), des analyses seront réalisées sous conditions natives.

Les approches de spectrométrie de masse native en mode top-down (nTD-MS) seront intégrées à des méthodes de chromatographie liquide et de spectrométrie de mobilité ionique sous conditions non dénaturantes (LC-nIM-MS) afin d'établir une corrélation directe entre la localisation de modifications spécifiques des protéoformes (oxydation, désamidation, isomérisation, etc.) et leur paysage conformationnel. Cette stratégie permettra de déterminer l'impact d'un large éventail de modifications de la structure primaire sur la structure d'ordre supérieur (HOS) des protéines thérapeutiques.

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des protéines thérapeutiques développées pour le traitement contre différentes pathologies comme le cancer, les maladies cardiovasculaires, l’asthme ou les maladies auto-immunes. Le succès des mAbs est lié à la spécificité de reconnaissance du mAb pour son antigène cible, le temps de demi-vie et la capacité pour induire une réponse immunitaire. Néanmoins, l’efficacité thérapeutique des mAbs reste limitée et des phénomènes de résistance ont été décrits. C’est la raison pour laquelle, des protéines dérivées de la structure des mAbs ont été développées comme les anticorps immunoconjugués (ADCs), des anticorps multi-spécifiques, les immunocytokines et les fragments d’anticorps (nanobodies). Ces protéines sont des molécules très complexes et la caractérisation analytique de ces composés reste un véritable défi dû à leur hétérogénéité intrinsèque (modifications post-traductionelles, PTMs, par exemple), la flexibilité associée à la région charnière et les modifications induites par la bioconjugaison (addition des molécules cytotoxiques ou de protéines immunes). Pour toutes ces raisons, le nombre de structures 3D des mAbs et produits dérivés répertorié dans les bases de données publiques reste très réduite. Malgré le développement de plusieurs techniques pour séparer et déterminer la coexistence des différentes populations de ces protéines (protéoformes), l’influence de ces modifications sur la conformation globale et la thermodynamique de ces protéines en phase gazeuse sont rarement prises en compte. L’objectif principal du projet conformAbs est le développement de techniques analytiques de caractérisation basées sur la spectrométrie de masse structurale pour déchiffrer la corrélation entre les différents protéoformes et la conformation globale de différents types de protéines thérapeutiques de taille et complexité croissantes : (nanobodies, mAbs, ADCs et les immunocytokines). Le projet s articule autour de 3 points :
1) l’ Identification et la localisation des modifications de la structure primaire de chaque protéoforme (PTMs, site de conjugaison…) des différents protéines thérapeutiques en utilisant des approches de type top- et/ou middle -down (TD/MD-MS) en conditions dénaturantes.
2) Le développement d’approches en mobilité ionique (IM) sur des instruments à haute résolution, d'expériences d’activation en phase gazeuse (CIU) en couplage avec la chromatographie liquide non dénaturante, pour la caractérisation des conformères et l’identification des différences de stabilité en phase gaze des protéines thérapeutiques.
3) l’élaboration d’une méthodologie intégrative qui combine des techniques de type top- et middle-down (TD/MD-MS) avec des approches de mobilité ionique (IM) en conditions natives pour décrypter l’influence directe des protéoformes sur la confirmation des protéines thérapeutiques.
La synergie obtenue à partir de la combinaison des résultats des expériences de top-down et middle-down en conditions natives (nTD/nMD-MS) avec les données de mobilité ionique et CIU en couplage avec les chromatographies non dénaturantes permettra l’obtention des informations clefs pour établir une relation précise entre le site de modification de la séquence de chaque proteoforme avec la structure globale et la stabilité en phase gazeuse de chaque protéine. Les résultats de ce projet contribueront à améliorer la caractérisation des mAbs et produits dérivés par l’identification des motifs structuraux sensibles à la dégradation ce qui permettra une amélioration dans la sélection des candidats des prochaines protéines thérapeutiques.