De la structure à la fonction: Comment les quadruplexes G contrôlent la diversification des anticorps et le destin des cellules B – AID-G4-CSR

Les cellules B ont la capacité remarquable de remanier leurs loci des Ig. Les cellules B matures diversifient ces loci par l’hypermutation somatique (HMS) et la commutation isotypique (CI). L’HMS aboutit à des clones cellulaires positivement sélectionnés, exprimant des anticorps de haute affinité. Les clones de faible affinité, auto-réactifs ou ne produisant plus d’anticorps sont négativement sélectionnés. Les mécanismes gouvernant la sélection négative demeurent largement inconnus.

L’HMS et la CI sont initiées par l’enzyme AID qui cible des cytosines exposées en ADN simple brin des séquences cibles transcrites. Les mécanismes gouvernant le ciblage d’AID à des séquences spécifiques des loci des Ig demeurent méconnus. Les structures en quadruplexes G (G4s) sont des acteurs importants dans la régulation génique, mais leur rôle dans les mécanismes de diversification des Ig et le destin des cellules B n’a pas été élucidé.

Par une combinaison d’analyses fonctionnelles, génétiques, mécanistiques et pharmacologiques, nous projetons de réaliser une importante avancée dans la compréhension du rôle précis des G4s dans le ciblage d’AID, la transcription, la CI et les recombinaisons non-classiques associées, chez l’Homme et la souris. De plus, nous démontrerons si AID cible directement l’ADN ou si elle requiert des intermédiaires ARN G4s et nous explorerons le rôle des G4s dans des recombinaisons non-classiques, médiées par AID, aboutissant à la mort cellulaire.

Ce projet implique 2 partenaires avec une solide expérience de la biologie du développement B normal et pathologique. Le projet est largement basé sur des modèles murins originaux disponibles, des lignées cellulaires humaines et murines, des ligands G4 caractérisés et des techniques de pointe. Le projet a 4 objectifs :

1: Exploration pharmacologique et épigénétique du rôle des G4s au cours de la CI (Khamlichi)
En utilisant des lignées murines disponibles dans lesquelles la transcription “switch” se fait uniquement dans l’orientation sens ou anti-sens, et des ligands G4 de sélectivité et activité définies, nous explorerons en profondeur les mécanismes par lesquels les G4s modulent le paysage épigénétique des séquences “switch”, la transcription sens et anti-sens et la CI in vivo.

2: Rôle des G4s et de l’épissage dans le ciblage d’AID (Khamlichi)
Le rôle de l’épissage dans la CI demeure un mystère. Nous utiliserons différents clones mutants d’une lignée B comportant des délétions qui affectent l’élongation transcriptionnelle et/ou l’épissage. L’idée sous-jacente est qu’en permettant l’élongation transcriptionnelle mais en bloquant l’épissage, nous pourrons déterminer l’efficacité du ciblage d’AID et de la CI en l’absence des produits intermédiaires de l’épissage.

3: Rôle régulateur des répétitions d’ADN non classiques et des G4s dans le locus IgH humain (Cogné)
Nous avons récemment découvert de nouveaux types de recombinaison illégitime impliquant des G4s très structurés, entrainant la délétion de séquences critiques du locus IgH. En utilisant un modèle murin humanisé, des lignées cellulaires humaines, des ligands G4s et des outils préservant les ARNs riches en G4 de la dégradation par le complexe « RNA exosome », nous explorerons en profondeur les rôles de ces séquences G4s dans la transcription, l’épissage alternatif et la recombinaison.

4: Les répétitions G4s et le “côté sombre” d’AID dans l’expression du locus IgH (Cogné)
Nous avons décrit des recombinaisons stoppant l’expression du locus IgH. Notre hypothèse est que ces recombinaisons, médiées par AID, contribuent à l’homéostasie B et entrainent la mort de cellules activées de manière sub-optimale. En utilisant des modèles murins originaux, des lignées cellulaires et des essais innovants, nous ciblerons le stade furtif qui précède la sélection négative et la mort cellulaire. Nous déterminerons comment des évènements génétiques spécifiques impliquant les G4s culminent en fonctions majeures régulant l’homéostasie B.