Caractérisation mécanistique et détaillé des frontières de Domaines Topologiquement Associés (« TAD ») en utilisant des approches complémentaires de séquençage à molécule unique et d'imagerie à super-résolution – TADwalker

Partant de notre observation selon laquelle les sites de liaison du CTCF sont souvent regroupés aux frontières des TAD, et compte tenu du fait que de nombreuses frontières s'étendent sur de longues distances, nous avons émis l'hypothèse que le site CTCF faisant office de frontière pourrait varier d'une cellule à l'autre. Pour étudier la nature dynamique des frontières des TAD et la fonction variable associée de chaque site de liaison du CTCF, nous avions besoin de technologies permettant de distinguer la fonction des frontières des TAD au sein des cellules uniques.

Pour atteindre notre objectif de distinguer les variations intercellulaires de la fonction des frontières des TAD, nous avons opté pour une approche combinant deux technologies complémentaires :

1. séquençage de molécules uniques (responsable du projet, Université Paris-Saclay / CNRS)

2. microscopie unicellulaire à super-résolution (partenaire du projet, University of Pennsylvania, États-Unis).

Ces technologies ont été appliquées à des cellules où la liaison du CTCF à la frontière d'un TAD pouvait être modulée de différentes manières :

1. Non modifié : la protéine CTCF pouvait se lier aux quatre sites naturels qui créent la séparation entre les TAD voisins.

2. Modification locale des sites de liaison du CTCF : un seul site a été supprimé, maintenant la liaison se fait à trois des quatre sites naturels.

3. Élimination de la grande majorité de la protéine CTCF dans les cellules : les quatre sites naturels ont été conservés, mais très peu de protéines (< 5 %) étaient disponibles pour s'y lier.

Parallèlement, nous avons appliqué une stratégie computationnelle pour caractériser plus en détail les frontières entre TAD et la liaison groupée du CTCF. De plus, grâce à une analyse approfondie des données et à des simulations informatiques basées sur la physique des polymères (qui reproduisent le comportement des longues molécules d'ADN constituant les chromosomes), nous avons déterminé si et comment la liaison groupée du CTCF influençait l'intégrité des TADs voisins.

Ce projet a abouti à deux résultats principaux :

1. Nos technologies complémentaires dans des cellules normales ont révélé que chaque site de liaison CTCF contribue à la séparation entre TAD voisins. Cependant, même à une frontière où quatre sites de liaison sont regroupés, nous constatons que dans environ 5 % des cas, les régions situées directement de part et d'autre de la frontière du TAD s'entremêlent.

>> Notre PREMIÈRE conclusion est que les frontières du TAD sont modérément perméables, ce qui permet la fusion de TADs dans une fraction de cellules.

En répétant ensuite ces expériences dans des cellules où le nombre de sites de liaison ou la quantité de protéine CTCF est réduit, nous avons montré que l'entremêlement augmentait.

>> Notre DEUXIÈME conclusion est que les sites de liaison CTCF contribuent de manière additive à la séparation entre TAD, fournissant ainsi un moyen codé par l'ADN de réguler la perméabilité des frontières : l'ajout de sites CTCF supplémentaires réduira la perméabilité.

2. Nos analyses computationnelles ont d'abord décrit la diversité des frontières des TAD. Nous avons constaté que les frontières varient en taille sur le chromosome, allant d'étroites (environ 10 % des frontières) à très étendues. Nous avons ensuite déterminé si la taille des frontières était liée à la distribution des sites de liaison CTCF. Nous avons alors trouvé une corrélation directe, confirmant que la liaison CTCF se produit dans une région plus étendue aux frontières étendues. À l'intérieur de ces frontières, les sites de liaison CTCF sont présents partout, sans préférence particulière (par exemple, aux extrémités). Ensuite, nous avons utilisé des simulations computationnelles pour déterminer si et comment des frontières plus ou moins étendues influencent le mélange entre les TAD voisins. Nous avons constaté ici une différence inattendue : les frontières étroites favorisent le brassage entre les TAD voisins. Cet effet n'est pas seulement apparu pour les régions proches des frontières, mais aussi beaucoup plus éloignées. Nos simulations ont révélé que cela est dû à un effet inattendu : les frontières attirent les domaines voisins, favorisant ainsi le brassage. Le même effet se produit pour les frontières étendues, mais la distance accrue entre les TAD voisins empêche le brassage. Après une nouvelle analyse des données biologiques, nous avons confirmé cet effet identifié par simulations.

>> Notre TROISIÈME conclusion est que la largeur des frontières influence le brassage des TAD voisins, qui s'étend sur de longues distances. L'espacement des sites de liaison du CTCF, codé par l'ADN, influence donc également le brassage des TAD sur des distances beaucoup plus longues.

Ces résultats aident à décoder la liaison du CTCF et la façon dont elle régule la communication entre les TAD, expliquant ainsi mieux comment des modifications de la séquence d'ADN peuvent perturber l'activité des gènes dans diverses pathologies.

Ce projet a confirmé comment les schémas de liaison à l'ADN de la protéine CTCF contribuent à moduler la perméabilité des frontières génomiques et, in extenso, la communication régulatrice entre TAD voisins. Pour l'instant, ces observations restent principalement limitées à la fonction de CTCF, que nous avons étudiée sur un petit nombre de frontières.

Dans des expériences complémentaires, notamment dans le cadre du projet InsulatorGrammar, financé par l'ANR, nous souhaitons poursuivre le décryptage de la manière dont la structure des frontières module la communication inter-domaines. Premièrement, nous souhaitons développer des approches permettant d'aborder ces questions de manière plus systématique : plutôt que de supprimer des parties d'une frontière et d'en étudier les effets, nous souhaitons construire nous-mêmes des frontières. Pour cela, nous construirons un système cellulaire qui nous permettra d'intégrer nos propres « frontières personnalisées », puis de mesurer précisément la communication régulatrice entre les deux côtés de la frontière. Deuxièmement, nous souhaitons étendre nos recherches au-delà du seul CTCF, car d'autres caractéristiques génomiques, notamment les gènes actifs, semblent également avoir la capacité d'agir comme frontières. Ici encore, l’incorporation d’autres caractéristiques génomiques dans nos « frontières personnalisées » sera déterminante.

Les « Domaines Topologiquement Associés » (TAD) séparent les génomes des vertébrés en compartiments fonctionnels pour la régulation transcriptionelle des gènes et la réplication, la recombinaison et la réparation de l'ADN (les « 3R »). La variation structurelle du génome peut provoquer la réorganisation des TAD. Ainsi, cette réorganisation a été rapportée dans une gamme de différents cancers et défauts embryonnaires, qui ont été principalement liés à la dérégulation des gènes à cause des contacts ectopiques avec des éléments « enhancers ».
Les TAD sont formés par un mécanisme d'extrusion des boucles, médié par le complexe Cohesin, qui nécessite un blocage aux frontières des TAD. Dans les vertébrés, la protéine CTCF se lie à la grande majorité de ces frontières. Les modèles courants pour la formation des TAD supposent qu'un seul site de liaison CTCF statique est suffisant pour créer une frontière entre TAD. Partenaire 1 a récemment rapporté que la plupart des frontières de TAD sont d’une nature modulaire où plusieurs sites de liaison CTCF se regroupent dans des zones de transition étendues. Nous postulons que ce regroupement va à l'encontre de la cinétique de liaison dynamique de l'ADN du CTCF. Partenaire 2, en utilisant « l'oligopainting à super-résolution », a rapporté que les domaines de chaque côté d'une frontière TAD peuvent s'entremêler dans des cellules individuelles, confirmant la capacité dynamique des frontières des TAD. Plus récemment, partenaire 1 a développé « Nano-C », une technologie qui permet d’analyser comment les sites CTCF individuels contribuent à la fonction des frontières des TAD. Partenaire 2 a récemment développé une version 100 fois plus efficace d'oligopainting compatible avec le FISH séquentiel multicolore. Jusqu'à présent, une caractérisation quantitative et moléculaire de la manière dont les frontières TAD modulaires et dynamiques interagissent avec la machinerie d'extrusion de boucle n'a pas été rapportée.
Dans notre projet « TADwalker », nous capitaliserons sur nos expertises complémentaires en Nano-C et imagerie à super-résolution pour effectuer une caractérisation moléculaire des frontières de TAD dans les cellules de souris. Pratiquement, nous combinerons la capacité d'exploration du Nano-C à identifier les éléments à fonction isolante et la capacité de l'imagerie à super-résolution à analyser quantitativement un grand nombre de cellules individuelles.
Pour atteindre notre objectif, le projet est divisé en trois lots. Dans un premier temps, nous générerons une description approfondie des frontières modulaires représentatives des TAD dans les cellules normales, qui servira de référence pour nos études mécanistiques. Deuxièmement, nous déterminerons les interactions moléculaires des frontières modulaires de TAD avec la machinerie d'extrusion des boucles. À cette fin, nous supprimerons, un par un, les principaux composants de la machinerie d'extrusion de boucle ou de la protéine CTCF, pour déterminer la façon dont la structure et l'isolation des frontières TAD sont affectées. Finalement, nous disséquerons précisément la nature modulaire des frontières des TAD en supprimant ou en inversant systématiquement les sites de liaison CTCF individuels. Encore une fois, nous mesurerons comment ces perturbations de la modularité des frontières influenceront la structure et la fonction isolante.
Le résultat de notre projet fournira une caractérisation moléculaire détaillée de la façon dont les frontières modulaires des TAD s'engagent avec la machine d'extrusion des boucles pour créer des TAD stables. Ces résultats permettront un raffinement important des modèles existants pour la structure et la fonction TAD. De plus, il fournira de nouvelles pistes pour expliquer comment la variation structurelle, située dans les zones de transition étendues formées par des limites modulaires de TAD, provoque des perturbations associées aux maladies de la régulation génique et les 3R.