Caractérisation mécanistique et détaillé des frontières de Domaines Topologiquement Associés (« TAD ») en utilisant des approches complémentaires de séquençage à molécule unique et d'imagerie à super-résolution – TADwalker

Les « Domaines Topologiquement Associés » (TAD) séparent les génomes des vertébrés en compartiments fonctionnels pour la régulation transcriptionelle des gènes et la réplication, la recombinaison et la réparation de l'ADN (les « 3R »). La variation structurelle du génome peut provoquer la réorganisation des TAD. Ainsi, cette réorganisation a été rapportée dans une gamme de différents cancers et défauts embryonnaires, qui ont été principalement liés à la dérégulation des gènes à cause des contacts ectopiques avec des éléments « enhancers ».
Les TAD sont formés par un mécanisme d'extrusion des boucles, médié par le complexe Cohesin, qui nécessite un blocage aux frontières des TAD. Dans les vertébrés, la protéine CTCF se lie à la grande majorité de ces frontières. Les modèles courants pour la formation des TAD supposent qu'un seul site de liaison CTCF statique est suffisant pour créer une frontière entre TAD. Partenaire 1 a récemment rapporté que la plupart des frontières de TAD sont d’une nature modulaire où plusieurs sites de liaison CTCF se regroupent dans des zones de transition étendues. Nous postulons que ce regroupement va à l'encontre de la cinétique de liaison dynamique de l'ADN du CTCF. Partenaire 2, en utilisant « l'oligopainting à super-résolution », a rapporté que les domaines de chaque côté d'une frontière TAD peuvent s'entremêler dans des cellules individuelles, confirmant la capacité dynamique des frontières des TAD. Plus récemment, partenaire 1 a développé « Nano-C », une technologie qui permet d’analyser comment les sites CTCF individuels contribuent à la fonction des frontières des TAD. Partenaire 2 a récemment développé une version 100 fois plus efficace d'oligopainting compatible avec le FISH séquentiel multicolore. Jusqu'à présent, une caractérisation quantitative et moléculaire de la manière dont les frontières TAD modulaires et dynamiques interagissent avec la machinerie d'extrusion de boucle n'a pas été rapportée.
Dans notre projet « TADwalker », nous capitaliserons sur nos expertises complémentaires en Nano-C et imagerie à super-résolution pour effectuer une caractérisation moléculaire des frontières de TAD dans les cellules de souris. Pratiquement, nous combinerons la capacité d'exploration du Nano-C à identifier les éléments à fonction isolante et la capacité de l'imagerie à super-résolution à analyser quantitativement un grand nombre de cellules individuelles.
Pour atteindre notre objectif, le projet est divisé en trois lots. Dans un premier temps, nous générerons une description approfondie des frontières modulaires représentatives des TAD dans les cellules normales, qui servira de référence pour nos études mécanistiques. Deuxièmement, nous déterminerons les interactions moléculaires des frontières modulaires de TAD avec la machinerie d'extrusion des boucles. À cette fin, nous supprimerons, un par un, les principaux composants de la machinerie d'extrusion de boucle ou de la protéine CTCF, pour déterminer la façon dont la structure et l'isolation des frontières TAD sont affectées. Finalement, nous disséquerons précisément la nature modulaire des frontières des TAD en supprimant ou en inversant systématiquement les sites de liaison CTCF individuels. Encore une fois, nous mesurerons comment ces perturbations de la modularité des frontières influenceront la structure et la fonction isolante.
Le résultat de notre projet fournira une caractérisation moléculaire détaillée de la façon dont les frontières modulaires des TAD s'engagent avec la machine d'extrusion des boucles pour créer des TAD stables. Ces résultats permettront un raffinement important des modèles existants pour la structure et la fonction TAD. De plus, il fournira de nouvelles pistes pour expliquer comment la variation structurelle, située dans les zones de transition étendues formées par des limites modulaires de TAD, provoque des perturbations associées aux maladies de la régulation génique et les 3R.