Architecture du système traductionnel mitochondrial d'algues en lien avec la maturation des ARNm – ARAMIS

Pour répondre au projet ARAMIS, nous avons combiné des approches de pointe en biologie moléculaire, génétique, biochimie et biologie structurale. Une telle approche intégrative nous a permis d’obtenir différents éclairages quant aux mécanismes de maturation des ARNm mitochondriaux et de leur traduction chez l’algue verte Chlamydomonas. Le projet a été développé selon trois axes majeurs :

Axe 1. Cet axe a permis d’identifier deux polyA polymérases non canoniques (PAP) impliquées dans la polycytidylation et l’uridylation des ARN mitochondriaux chez Chlamydomonas. Leur localisation mitochondriale a été confirmée par microscopie confocale (par expression de protéines recombinantes en fusion avec la GFP) et western blot après purification des mitochondries. Des approches de génétique inverse (mutants CLiP, knockdown par amiRNA) ont permis d’évaluer leur fonction, avec un phénotypage basé sur la croissance en obscurité et la respiration. Les défauts de maturation des ARN ont été analysés par northern blot, RNA-seq, 5’-Race-seq et protéomique.

Axe2. Cet axe avait pour objectif de déterminer la structure du mitoribosome de Chlamydomonas à très haute résolution et d’élucider le rôle des protéines à domaines hélicoidaux répétés (protéines HRP). Grâce à la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), l’équipe a optimisé la purification des mitoribosomes (amélioration du rendement, de la pureté et de l’intégrité) en utilisant des détergents variés pour solubiliser les ribosomes associés à la membrane interne. Un tri d’images de particules a permis d’obtenir la structure du mitoribosome. Parallèlement, une caractérisation fonctionnelle des protéines HRP a été menée via des mutants amiRNA générés au laboratoire, avec un phénotypage basé sur la croissance à l’obscurité et la stabilité des fragments d’ARN ribosomiques.

Axe 3. Cet axe visait à élucider les mécanismes d’initiation de la traduction des ARNm sans séquence « leader » chez Chlamydomonas et à établir un potentiel lien avec leur maturation. Pour cela, une version étiquetée du facteur mtIF3 a été exprimé dans une souche de Chlamydomonas. Après une étape de co-immunoprécipitation pour purifier les complexes d’initiation de la traduction, les partenaires protéiques sont analysés par spectrométrie de masse. Ce travail est encore en cours d’analyse. De même, pour résoudre leur structure à haute résolution, des premiers essais de cryo-EM ont été initiés. Du ribosome profiling permettant de comparer les profils de traduction entre souches sauvages et mutants PAP, en analysant les fragments d’ARN protégés par les ribosomes, pourra être réalisé dans le futur.

Dans le cadre de l’axe 1, deux nuclétotidyl transférases appartenant à la famille des polyA polymérases non canoniques (PAP), PAP4 et PAP6, ont été caractérisées. L’analyse par 3’ RACE-seq ou RNA-seq, des transcrits mitochondriaux de lignées mutantes et de la composition de leurs queues ajoutées post-transcriptionnellement en 3’ a montré que PAP4 semble l’enzyme impliquée dans l’ajout des résidus C, alors que l’enzyme PAP6 serait impliquée dans l’uridylation des ARNm. Des protéines recombinantes de PAP4 et PAP6 exprimées en système bactérien ont été purifiées et utilisées pour des tests d’activité in vitro d’ajout de nucléotides sur de petits ARN substrats, confirmant les résultats obtenus avec l’analyse des souches mutantes. L’analyse par qPCR du niveau stable des ARNm mitochondriaux de Chlamydomonas suggère que les queues polyC-riches permettent leur stabilisation alors que les queues polyU-riches entraînent leur dégradation.

Dans le cadre de l’axe 2, une caractérisation biochimique et structurale du mitoribosome de Chlamydomonas et une étude fonctionnelle de certains de ses composants spécifiques ont été réalisées. La cryo-microscopie électronique à particules a permis de révéler comment le mitoribosome de Chlamydomonas s’assemble à partir de 13 fragments d’ARNr, codés par des segments génétiques non contigus. De nouvelles protéines, principalement des protéines à répétitions hélicoïdales (OPR, PPR et mTERF), ont été identifiées dans ce mitoribosome, révélant ainsi la première structure d’une protéine OPR en complexe avec sa cible ARN. L’obtention de mutants amiRNA a permis de démontrer que ces protéines ribosomiques sont essentielles à l’intégrité du mitoribosome. En collaboration avec l’équipe de B. Engel (Biozentrum, Basel), la cryo-tomographie électronique a montré que ces mitoribosomes sont ancrés à la membrane interne mitochondriale. Cette étude fournit le premier exemple d’un ribosome composé de fragments d’ARNr, révélant un assemblage remarquablement divergent pour cette machine moléculaire pourtant conservée au cours de l’évolution.

Dans le cadre de l’axe 3, l’objectif était d’étudier les mécanismes sous-jacents à l’initiation de la traduction des ARNm mitochondriaux dépourvus de séquence 5′ chez Chlamydomonas, en identifiant les complexes formés lors des premières étapes de ce processus. Nous avons tout d’abord identifié les facteurs d’initiation mitochondriaux IF2 et IF3. Une souche de Chlamydomonas exprimant une version de mtIF3 fusionnée à un tag FLAG a ensuite été générée. Des expériences de co-immunoprécipitation ont été réalisées à partir de mitochondries purifiées issues de cette souche. Les résultats préliminaires ont mis en évidence la présence de sous-unités du mitoribosome, validant ainsi la pertinence de l’approche expérimentale.

Nos travaux ont permis d’identifier les protéines impliquées dans l’ajout des queues riches en polyC et en polyU aux ARN messagers mitochondriaux de Chlamydomonas. Bien que nous ayons initialement émis l’hypothèse que les queues riches en polyA étaient synthétisées par la même enzyme que celles riches en polyU, nos analyses récentes suggèrent l’intervention d’une enzyme distincte, qui reste à identifier, tout comme la fonction spécifique de ces queues riches en polyA. Par ailleurs, si l’enzyme responsable de l’ajout des queues riches en polyC a été identifiée, le mécanisme par lequel ces queues contribuent à la stabilisation des transcrits demeure à élucider.

La résolution structurale du mitoribosome a mis en évidence des protéines spécifiques à Chlamydomonas : certaines interagissent avec l’ARN ribosomique afin d’en assurer la stabilisation, tandis que d’autres participent à son ancrage à la membrane interne mitochondriale. Néanmoins, plusieurs protéines identifiées restent de fonction inconnue. De plus, la résolution actuelle (3 Å pour la grande sous-unité et 5 Å pour la petite sous-unité) ne permet pas encore une identification exhaustive des protéines composant le mitoribosome. Certains volumes observés en cryo-tomographie électronique restent également à caractériser. Enfin, le mécanisme d’assemblage des 13 fragments d’ARN ribosomique, dispersés dans le génome mitochondrial, pour former un mitoribosome fonctionnel, constitue encore une question ouverte.

Un défi majeur réside dans la compréhension du mécanisme de chargement des ARNm mitochondriaux dans la petite sous-unité du mitoribosome, permettant le positionnement correct du codon initiateur pour la traduction. Contrairement à la situation observée chez l’humain, où une protéine spécifique reconnaît une séquence riche en U située en aval du codon initiateur, ce mécanisme ne semble pas transposable à Chlamydomonas. Des outils ont été développés pour étudier ce processus, et les résultats préliminaires sont encourageants. Ces travaux devront être poursuivis afin de répondre à cette question fondamentale.

Il y a environ deux milliards d'années, l'acquisition de la mitochondrie, un organite endosymbiotique pourvu d’une double membrane, a considérablement influencé l'évolution des cellules eucaryotes. Les mitochondries sont au cœur de la bioénergétique des eucaryotes, avec leur fonction principale dans la production d'ATP par phosphorylation oxydative et leurs rôles importants dans des processus fondamentaux tels que l'apoptose, le vieillissement ou le développement.

Depuis l’intégration de la bactérie endosymbiotique dans une cellule proto-eucaryote ancestrale, les mitochondries ont considérablement évolué. Ces organites combinent désormais des traits bactériens hérités de leur ancêtre procaryote avec des caractéristiques distinctives qui sont apparues au cours de l'histoire des eucaryotes. L'expression des gènes mitochondriaux dépend de l'expression coordonnée des génomes mitochondrial et nucléaire et, par conséquent, de l'interaction entre des facteurs d’origine procaryote et eucaryote.

Plusieurs résultats récents ont souligné l'extraordinaire diversification des mitochondries. En particulier, des structures à haute résolution de mitoribosomes ont été obtenues pour différents eucaryotes, révélant d'énormes différences structurales avec les ribosomes bactériens et entre eux. Leurs architectures montrent des variations significatives mettant en évidence une diversité inattendue des systèmes de traduction mitochondriaux. La composition et la structure des mitoribosomes des plantes terrestres qui ont été récemment déterminées sont particulièrement remarquables. Dans le prolongement de ces recherches récentes, comprendre la dérive évolutive des mitochondries dans différentes lignées eucaryotes représente un défi fascinant. Des études complémentaires sont donc essentielles pour appréhender pleinement la diversité des processus d'expression du génome mitochondrial dans des lignées eucaryotes encore inexplorées.

Le projet ARAMIS vise à obtenir des informations mécanistiques détaillées sur la maturation des ARNm et le système traductionnel dans un organisme modèle de premier plan, l'algue verte unicellulaire, Chlamydomonas reinhardtii. Son génome mitochondrial possède des caractéristiques remarquables. Tous les ARNm mitochondriaux commencent directement au codon d'initiation AUG et se terminent par des queues riches en Cytidines, une caractéristique que nous avons récemment découverte. Les ARN ribosomaux sont fragmentés et notre caractérisation en cours du mitoribosome de Chlamydomonas, par cryo-microscopie électronique combinée à des études biochimiques et fonctionnelles, révèle plusieurs particularités. Ainsi, nous avons identifié un nouveau petit ARN correspondant à l'ARNr 5S, ainsi qu’une dizaine de nouvelles protéines spécifiques possédant des motifs à répétition hélicoïdale, en particulier des protéines à « octotricopeptide repeat » (OPR).

Ce projet qui repose sur des résultats préliminaires solides est porté par un consortium de quatre partenaires collaborant avec succès depuis plusieurs années. Caractériser la machinerie traductionnelle mitochondriale de l'algue modèle Chlamydomonas et comprendre comment son activité est liée à la maturation des ARNm constitue la question biologique centrale. Une analyse intégrative réalisée aux niveaux biochimique, génétique et structural permettra de déterminer :
- Les facteurs protéiques associés à la maturation des ARNm mitochondriaux.
- La composition, la structure et la fonction du mitoribosome et le rôle des nouvelles protéines OPR.
- Les mécanismes moléculaires associés à l'initiation de la traduction mitochondriale et l’interaction entre ce processus et la maturation des ARNm.
Dans son ensemble, ARAMIS sera déterminant pour mieux appréhender la biologie de l'expression du génome mitochondrial chez les algues. Il contribuera fortement à la compréhension de la diversité et de l'évolution des systèmes d'expression des génomes mitochondriaux chez les eucaryotes.