RA-COVID-19 V7 - Recherche - Action Coronavirus disease 2019 - Vague 7

Role moléculaire de la nucléoprotéine virale dans le cycle de réplication du SRAS-Cov-2 – SARS2NUCLEOPROTEIN

Résumé de soumission

Afin d'élaborer des stratégies pour le développement d'inhibiteurs du SRAS-CoV-2, il est essentiel de comprendre la base moléculaire des différents aspects du cycle viral. Les coronavirus sont des virus à ARN simple brin enveloppés à sens positif qui expriment leur propre mécanisme de réplication. La réplication du SARS-CoV-2 est assurée par l’ARN polymérase. Les processus de réplication et de transcription du génome représentent des cibles importantes pour l'inhibition virale.
La nucléoprotéine du SARS-CoV-2 (N) est un cofacteur important du complexe de réplication virale, encapsidant le génome viral, le protégeant ainsi de l'environnement de la cellule hôte, et régulant la transcription des gènes dans la cellule infectée. La base moléculaire de son rôle dans la régulation de la transcription reste inconnue. Il a récemment été démontré dans l'étude SARS-CoV-1 que cette colocalisation dépend d'une interaction essentielle avec le composant N-terminal d'une autre protéine virale Nsp3 (Nsp3a).
N est une protéine hautement dynamique, comprenant cinq domaines, dont trois sont prédits d’être intrinsèquement désordonnés. Les caractéristiques structurelles du N sont fortement conservées entre coronaviridae, avec 90 % d'identité de séquence entre le SRAS-CoV-1 et le SRAS-CoV-2. Les deux domaines repliés se lient à l'ARN, et le domaine replié C-terminale est responsable de l'oligomérisation et de la formation d'assemblages d'ordre supérieur qui forment la nucléocapside. Le domaine de liaison central comprend un domaine riche en sérine-arginine (SR) qui est phosphorylé, une modification qui a un impact sur la régulation des gènes et l'efficacité de la réplication.
N subit une séparation de phase liquide-liquide formant des condensats biomoléculaires par mélange avec l'ARN. La phosphorylation du domaine de liaison central module la nature liquide des gouttelettes. Il a été démontré que la formation de ces organites sans membrane se produit pour les virus à ARN de sens négatif, tels que les virus de la rougeole, de la rage et de la nipah, où les nucléoprotéines et les phosphoprotéines forment des gouttelettes liquides. Il a aussi été démontré que la formation de telles usines virales améliore des processus tels que l'encapsidation du génome viral. La base moléculaire de la stabilisation de ce phénomène reste inconnue dans le cas du SRAS-CoV-2.
Nsp3a est également une protéine très dynamique, avec un domaine replié de type ubiquitine et un long domaine desordonné à l'extrémité C-terminale. Le rôle de ce domaine n'est pas connu, mais il est plus long de 23 acides aminés dans le cas du SRAS-CoV-2 que dans le SRAS-CoV-1.
Dans ce projet, nous visons à caractériser le comportement conformationnel de N du SRAS-CoV-2 à résolution atomique en utilisant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), la diffusion des rayons X à petit angle (SAXS) et la microscopie et la spectroscopie de fluorescence ainsi que son interaction avec le cofacteur viral Nsp3a. Nous caractériserons l'impact de la phosphorylation sur la dynamique conformationnelle et sur l'interaction avec Nsp3a. Nous étudierons l'impact de la phosphorylation et de l'interaction avec Nsp3a sur la formation et la nature des gouttelettes de liquide SARS-CoV-2. Nous étudierons également la possibilité d'observer la cinétique et les bases structurelles de l'assemblage des nucléocapsides sur l'ARN in vitro.
Cette étude permettra de caractériser les principales interactions impliquant N, jetant ainsi les bases pour la conception d'éventuel inhibiteurs de la réplication virale (par exemple les peptides qui miment les sites d'interaction dans les domaines desordonnées) et entre ainsi dans la catégorie "Physiopathogénèse de la maladie". Le groupe de coordination est membre du consortium COVID19-NMR (covid19-nmr.de) dont le but est d'acquérir et de diffuser rapidement des informations basées sur la RMN sur les protéines Sars-CoV-2 et l'ARN.

Coordination du projet

Martin BLACKLEDGE (INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IBS INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE

Aide de l'ANR 77 431 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2020 - 12 Mois

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