Approches protéomiques et pharmacologiques pour caractériser les mécanismes moléculaires régulant l'expression et la libération de la protéine IL-33 endogène – PROTEOMICS-IL33

Afin de fournir des éléments de réponse aux questions fondamentales concernant l’IL-33, nous avons combiné des approches de biochimie des protéines, de protéomique (identification de milliers de protéines par spectrométrie de masse à haut-débit), de biologie moléculaire et cellulaire, de génomique fonctionnelle (souris déficientes pour l’IL-33) et de pharmacologie (utilisation de petites molécules chimiques inhibitrices).

Un des points forts du projet résidait dans la complémentarité et la multidisciplinarité des deux équipes impliquées, et la très grande expertise de l’équipe coordinatrice sur l’IL-33 - plus de 20 ans d’expérience, ce qui la positionne parmi les équipes leaders du domaine au niveau international.

Le projet a pu bénéficier des nombreux instruments et outils biologiques disponibles au sein des deux équipes impliquées. De nombreux réactifs vendus dans le commerce sont défaillants, y compris les réactifs provenant d'entreprises réputées. C’est le cas par exemple de nombreux anticorps sensés reconnaitre l’IL-33, anticorps qui dans nos conditions expérimentales donnent les mêmes marquages avec des cellules produisant l’IL-33 qu’avec des cellules déficientes en IL-33.

Au cours des 15 dernières années, nous avons développé et/ou validé de nombreux outils pour la détection spécifique de la protéine IL-33 endogène, aussi bien la protéine IL-33 humaine dans des cellules humaines primaires en culture que la protéine IL-33 murine dans des tissus de souris in vivo (développement d’un modèle murin déficient en IL-33 ; anticorps spécifiques pour les expériences d’immunofluorescence, d’immunoprécipitation et de western blot). Ces outils ont constitué un atout majeur pour le projet.

Le projet a apporté de nouveaux éléments de réponse à l’une des questions fondamentales concernant l’IL-33 : comment la protéine stockée à l’intérieur du noyau des cellules productrices est-elle libérée à l’extérieur des cellules ?

Nous avons constaté que l'IL-33 endogène est libérée très rapidement in vivo par un mécanisme de lésion/mort cellulaire. Au cours de ces expériences, nous avons découvert qu’une autre cytokine (TL1A) est libérée en même temps que l'IL-33, quelques minutes après l'exposition à la moisissure Alternaria alternata, un allergène d'intérêt clinique majeur, associé notamment à la sévérité de l’asthme.

Nous avons observé qu'un seul traitement intranasal de souris naïves avec des extraits d'A. alternata entraînait la libération de l’IL-33 et du TL1A dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire dans les 15 premières minutes suivant l'exposition à l'allergène. Nous avons constaté que la libération de l’IL-33 et du TL1A était associée à une augmentation des taux de LDH, un marqueur de lésion membranaire et de mort cellulaire. L'IL-33 et le TL1A s'accumulent dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire au cours des premières heures, puis diminuent par la suite (24 à 48 h). Nos résultats ont révélé que l’IL-33 et le TL1A sont des cytokines de type « alarmine » qui fonctionnent comme un puissant signal d’alarme : IL-33 et TL1A qui sont produites dans les cellules épithéliales pulmonaires à l'état basal (préformées), sont libérées rapidement et simultanément lors de lésions ou de mort cellulaires, et coopèrent afin d’alerter les globules blancs (ILC2) du dommage tissulaire.

Nous avons réalisé des tests d'immunoprécipitation et des analyses par western blot afin d'identifier les formes d'IL-33 libérées in vivo. Une seule exposition de souris naïves à une faible dose d'extraits d'A. alternata, suffisante pour induire une inflammation allergique des voies respiratoires, a entraîné la libération immédiate (~ 5 min) de la protéine IL-33 entière dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire. Cependant, nous avons constaté que cette forme entière ne s'accumulait pas en raison de son clivage rapide en formes plus courtes par les protéases d'A. alternata. Nous avons conclu que la protéine IL-33 endogène est rapidement libérée in vivo et activée via un mécanisme en deux étapes : libération immédiate de la protéine non clivée après une seule exposition à l’allergène (étape 1), suivie d'un clivage rapide par les protéases de l'allergène, en une forme hyperactive plus courte (étape 2).

Nous avons utilisé une approche protéomique à grande échelle pour analyser de manière non biaisée la coopération entre l'IL-33 et le TL1A lors de l'activation précoce des cellules ILC2 pulmonaires. Nous avons constaté que, suite à une activation synergique par l'IL-33 et le TL1A, les ILC2 pulmonaires acquièrent un phénotype activé, caractérisé par une production massive d'IL-9, une cytokine de type 2 associée à l'inflammation allergique et à l'asthme.

L'inflammation allergique joue un rôle crucial dans les maladies respiratoires allergiques, telles que l'asthme et la rhinite allergique. Bien que l'épithélium pulmonaire, qui constitue la surface interne des poumons, soit reconnu comme un acteur majeur, les mécanismes sous-jacents restent encore mal compris. Notre projet a révélé que la coopération entre l'IL-33 et une nouvelle alarmine, le TL1A, est importante pour le déclenchement des réactions allergiques. Nous avons montré que ces deux alarmines sont libérées par les cellules épithéliales pulmonaires quelques minutes après l'exposition à l'allergène et qu'elles coopèrent pour alerter le système immunitaire.

Les alarmines constituent des cibles thérapeutiques majeures pour le traitement des maladies respiratoires allergiques. D'ici quelques années, des traitements à base d'anticorps bloquant les alarmines IL-33 ou TL1A pourraient être bénéfiques aux patients souffrant d'asthme sévère ou d'autres maladies allergiques. En France, au moins 17 millions de personnes sont touchées par des maladies allergiques, les formes les plus sévères d'asthme étant responsables de plusieurs centaines de décès chaque année.

Outre les résultats décrits dans les paragraphes précédents, d'autres résultats importants ont été obtenus au cours du projet PROTEOMICS-IL33. De plus, de nouveaux outils ont été développés, notamment une série d'anticorps monoclonaux reconnaissant différentes formes de la protéine IL-33 humaine (forme complète et formes hyperactives). Ces outils constituent un atout essentiel pour déterminer quelles formes d'IL-33 humaine sont libérées in vivo.

Un nouveau projet, entièrement basé sur les résultats obtenus et les outils développés dans le cadre du projet PROTEOMICS-IL33, et impliquant les mêmes partenaires, a été sélectionné par l'ANR en 2025 : ALARMIN-ALLERGY – « Rôles, régulation et coopération des alarmines IL-33 et TL1A dans l'initiation de l'inflammation allergique des voies respiratoires ».

Les principaux objectifs du projet ALARMIN-ALLERGY sont de mieux définir les rôles et la régulation de l'IL-33 humaine in vivo, et de mieux caractériser la coopération entre l’IL-33 et le TL1A lors de l’initiation de l’inflammation allergique des voies respiratoires.

Les maladies allergiques telles que l’asthme, la rhinite allergique et l’eczéma sont des maladies fréquentes qui touchent de nombreux patients de l’enfance à l’âge adulte. D'après les estimations de l'Organisation Mondiale de la Santé, il y a actuellement 235 millions de personnes qui souffrent d’asthme dans le monde. Il est donc très important de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux des réactions allergiques.
Des études génétiques à grande échelle impliquant des milliers de patients ont permis d’identifier de façon récurrente deux gènes majeurs de prédisposition à l’asthme, les gènes codant pour l’Interleukine-33 (IL-33) et son récepteur (ST2). L’IL-33 est une protéine qui appartient à la famille des interleukines, des messagers solubles qui permettent aux cellules de communiquer entre elles et qui ont un rôle majeur dans l’inflammation des tissus. Cette protéine, stockée dans les vaisseaux sanguins et les barrières épithéliales (poumons, peau,…) n’est libérée qu’en cas de dommage cellulaire. Elle agit comme un signal d’alarme qui prévient l’organisme lors d’un traumatisme ou d’une infection en stimulant de nombreuses cellules du système immunitaire, en particulier différents types de globules blancs impliqués dans les réactions allergiques (lymphocytes, éosinophiles, mastocytes, cellules lymphoides innées du groupe 2).
Les individus ayant une plus faible quantité de protéines IL-33 dans l’organisme suite à une mutation génétique dans le gène IL33 ont moins de risque de développer un asthme ou une rhinite allergique. C’est pourquoi, la protéine IL-33 constitue une cible thérapeutique prometteuse pour l’asthme et les autres maladies allergiques, et des essais cliniques avec des anticorps bloquants sont actuellement en cours (Phase II).
Cependant, de nombreuses inconnues demeurent concernant la biologie et la biochimie de la protéine. Parmi les questions importantes qui restent posées :
- Comment les quantités de protéine IL-33 dans les cellules productrices sont-elles déterminées ?
- Comment la protéine IL-33 est-elle libérée dans le milieu extracellulaire après exposition à des allergènes de l’environnement ou à un stress mécanique ?
L'objectif majeur de notre projet est de fournir des éléments de réponse à ces deux questions fondamentales. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des approches de biochimie des protéines, de protéomique (identification de milliers de protéines par spectrométrie de masse à haut-débit), de biologie moléculaire et cellulaire, de génomique fonctionnelle et de pharmacologie (utilisation de petites molécules chimiques inhibitrices).
Au vu de notre expertise, des outils/méthodes disponibles et des résultats déjà obtenus, nous pensons que le projet conduira à plusieurs avancées majeures dans la compréhension de la biologie de l'IL-33 et des mécanismes impliqués dans les réactions inflammatoires allergiques. Le projet pourrait également ouvrir des perspectives thérapeutiques prometteuses et moins onéreuses que l’utilisation d’anticorps monoclonaux pour le traitement de l’asthme et des autres maladies allergiques.
Un point fort du projet sera la complémentarité et la multidisciplinarité des deux équipes impliquées, et la grande expertise de l’équipe coordinatrice sur l’IL-33 (> 15 ans) qui la positionne parmi les équipes leaders du domaine an niveau international