Nouveaux systèmes d'aminoacylation de lipides – N-FLAMS

Pour la localisation subcellulaire des protéines ErdS et ErdH, deux approches sont utilisées. La première consiste à construire une souche recombinante d’Afm, avec une étiquette GFP pour ErdS et une étiquette mCherry pour ErdH (GFP-erdS-mCherry-erdH). Une deuxième approche utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine ErdS sera utilisée en parallèle si nous rencontrons des difficultés à construire la souche d’Afm exprimant GFP-erdS-mCherry-erdH. Ces deux approches permettront grâce à des expériences d’immunofluorescence et de Westren Blot (WB) de détecter et localiser ErdS aux différents stades de développement du champignon. Ces deux approches complémentaires permettront également de réaliser des co-localisations avec des composants de la paroi et de la membrane fongique (?-glucane, chitine, Erg…) en utilisant des marqueurs spécifiques de la paroi et de la membrane. Les résultats obtenus donneront une indication quant au rôle de l’Erg-Asp dans le développement du champignon.
Les changements transcriptionnels induit par l’absence de l’Erg-Asp seront étudiés en analysant le transcriptome des souches WT, ?erdS et des isolats cliniques en conditions standard de croissance. Des cultures des différentes souches sont réalisées sur du cellophane stérile posé sur un milieu riche gélosé, puis les cultures sont collectées au bout de 72 heures et les ARN totaux extraits (TRIzol®). Les échantillons sont ensuite analysés par la plate de transcription de l’IGBMC par mRNA-seq (Illumina HiSeq 4000 sequencer). Des triplicata techniques et biologiques sont réalisés.
Le rôle de l’Erg-Asp dans la réponse immunitaire et la résistance aux antifongiques sera également étudié puisque l’Erg est la cible principale des médicaments antifongiques disponibles. Notre hypothèse est que l’Erg-Asp pourrait jouer un rôle dans la susceptibilité d’Afm aux agents antifongiques utilisés en médecine humaine. Afin de la vérifier, des tests de susceptibilité aux antifongiques utilisés en milieu hospitalier (viabilité cellulaire à la résazurine) tels que les azoles et l’amphothéricine B sont réalisés avec les souches WT, ?erdS et les isolats cliniques. Nous souhaitons aussi étudier la possible implication de l’Erg-Asp dans la réponse immunitaire de l’hôte, notamment l’échappement d’Afm au système immunitaire et sa virulence. Pour cela, la phagocytose de spores de nos souches (WT et ?erdS) y compris des souches cliniques ainsi que la virulence sont étudiées en utilisant un système in vitro de phagocytose (macrophages de souris infectés par le champignon) et un modèle d’infection d’insecte Galleria mellonella. Des cinétiques d’infection et différentes doses de spores dormantes ou gonflées sont utilisées. La phagocytose est quantifiée au bout de 3 heures et la survie des larves après infection suivie sur 24 et 48 heures pour déterminer les doses létales 90 et 50%. La production de cytokines et autres médiateurs immunitaires sera également mesurée.

Nous avons d’ores et déjà des premières indications sur la localisation d’ErdS dans les cellules du champignon à différents stades de développement d’Afm (spores, tube germinatif et mycélium) par immunofluorescence. La protéine est localisée au niveau des compartiments membranaires du champignon et cette localisation est en accord avec les premiers WB réalisés sur des fractionnement subcellulaires d’extraits de levures exprimant ErdS. En parallèle nous avons construire une souche recombinante GFP-erdS-mCherry-erdH d’Afm et obtenus 50 clones sélectionnés sur milieu sélectif. Ces clones ont été vérifiés par PCR. Cependant aucun ne contenait la construction voulue. Une deuxième tentative est en cours. Dans l’optique de comprendre le rôle de l’Erg-Asp chez Afm, des études phénotypiques ont été entreprises sur utilisant différentes conditions de croissance (carence, stress, etc). Les premiers résultats montrent (i) une modification de la distribution des composants de la membrane et de la paroi fongique (chitine, ?-glucane, Erg, etc), (ii) un défaut de croissance en présence d’un stress tel que le traitement au Congo Red, (iii) et une résistance au stress osmotique de la souche ?erdS. Nous avons également observé la présence de petites structures sombres de mycélium condensées dans la souche ?erdS. Ces premiers résultats tendent à suggérer un rôle de l’Erg-Asp dans le remodelage de la paroi et la membrane fongique comme molécule de signalling. Afin de mettre en évidence l’implication de l’Erg-Asp dans la régulation transcriptionnelle de gènes et donc potentiellement dans un réseau de régulation, une analyse RNA-Seq a été entreprise sur les souches WT, ?erdS et deux souches cliniques d’Afm. Les ARN totaux issus de triplicatas biologiques et techniques de ces souches sont en cours d’analyse (plateforme IGBMC). Pour valider l’hypothèse selon laquelle, l’Erg-Asp pourrait jouer un rôle dans la susceptibilité d’Afm aux agents antifongiques, des tests de viabilité cellulaire ont été réalisés et montrent aucune différence dans la susceptibilité ou résistance aux antifongiques entre notre souche sauvage et notre souche ?erdS suggérant que l’Erg-Asp n’est pas impliqué dans la résistance aux antifongiques. Un résultat similaire est observé avec deux souches cliniques, l’une d’elle ne possède pas l’Erg-Asp. De même, les expériences de virulence ne montrent aucune différence dans la viabilité des larves infectées soit avec la souche WT soit la souche ?erdS. En revanche, les premiers résultats de l’analyse de la phagocytose, en utilisant des macrophages de souris infectées par des spores (conidia) WT ou ?erdS, montrent une différence dans le niveau d’internalisation des spores par les macrophages. Les spores de la souches ?erdS semblent moins bien internalisées que les spores WT, suggérant que l’Erg-asp pourrait moduler la reconnaissance du champignon par les macrophages.

Pour mener à bien la projet N-FLAMS et déchiffrer le rôle de l’Erg-Asp dans la physiopathologie du champignon Aspergillus fumigatus (Afm), nous souhaitons poursuivre notre analyse de la localisation d’ErdS/ErdH et de l’Erg-Asp ; et identifier les partenaires d’ErdS/ErdH ainsi que d’Erg-Asp. Pour cela, nous sommes en train de construire une souche recombinante GFP-erdS-mCherry-erdH, une fois la souche recombinante obtenue, des expériences d’immunofluorescences et de pull-down/Co-IP pourront être réalisées pour (i) localisés les deux protéines et confirmer les résultats d’immunolocalisation obtenus avec l’anticorps anti-ErdS et (ii) identifier les différents partenaires interagissant avec ErdS :ErdH par pull-down/Co-IP suivis d’une analyse par spectroscopie de masse. Nous souhaitons également confirmer la localisation membranaire de ErdS au cours du développement du champignon en réalisant des co-localisations avec les composants de la membrane tel que l’ergosterol et/ou avec des protéines connues comme étant membranaires. De même, des western-blots seront réalisés sur des fractionnement cellulaire d’Afm traités ou non avec des détergents afin de confirmer la localisation membranaire directement chez le champignon. Une fois les résultats de l’analyse transcriptionnelle (RNA-seq) obtenus, des vérifications par RT-QPCR seront effectuées et la construction de nouvelles souches mutantes pour les gènes dont la transcription est modulée par ErdS/erdH/Erg-Asp sera réalisée et des études phénotypiques entreprises. Le développement de techniques de détection de l’Erg-Asp par spectrométrie de masse, en utilisant les différentes souches d’Afm (WT, ?erdS et isolats cliniques) sera poursuivie. Ceci permettra d’identifier des intermédiaires métaboliques de l’Erg aminoacylés par ErdS. Nos premiers résultats sur la virulence ne semblent pas, dans nos conditions, montrer de différence entre la souche WT et mutée. Cependant une analyse plus poussée de la réponse immunitaire de l’insecte sera entreprise en réalisant par exemple des cinétiques d’infections et différentes doses de spores injectées à l’insecte, la quantification des hemocytes (cellule du système immunitaire de l’insecte) avant et après infection, la quantification ou la détection des peptides antimicrobiens par SM, etc. Enfin, nos premiers résultats sur l’implication de l’Erg-Asp dans la réponse immunitaire de l’hôte semble montrer qu’en l’absence de l’erg-Asp une modification la réponse, en particulier l’internalisation des spores par le macrophage. Nous souhaitons étudier en détail, la réponse immunitaire de l’hôte en utilisant des macrophages de souris dans un premier temps pour (i) analyser les quatre étapes de phagocytose (liaison récepteur-ligand, internalisation, phagosome mature et destruction du champignon), (ii) quantifier la production de cytokines et (iii) quantifier la production des ROS (reactive oxygen species).

Articles

Yokokawa, D., Tatematsu, S., Takagi, R., Sga, R., Roy, H., Fischer, F., Becker, H. D. & Kushiro, T. (2021) Synthesis of aminoacylated ergosterols: a new lipid component of fungi. Steroïds 169, 108823 (doi:10.1016/j.steroids.2021.108823)

Darnet S, Blary A, Chevalier Q, Schaller H. (2021) Phytosterol profiles, genomes and enzymes. Front. Plant. Sci. 12, 665206. (doi: 10.3389/fpls.2021.665206)

Yakobov N, Mahmoudi N, Grob G, Yokokawa D, Saga Y, Kushiro T, Worrell D, Roy H, Schaller H, Senger B, Huck L, Gascon GR, Becker H & Fischer F. (2022) RNA-dependent synthesis of ergosteryl-3ß-O-glycine in Ascomycota expands the diversity of steryl-amino acids. Journal of Biological Chemistry. 298(3):101657. (doi: 10.1016/j.jbc.2022.101657)

Grob G, Hemmerle M, Yakobov N, Mahmoudi N, Fischer F, Senger B, Becker HD. (2022) tRNA-dependent addition of amino acids to cell wall and membrane components. Biochimie. 30:S0300-9084(22)00253-X;(doi: 10.1016/j.biochi.2022.09.017)

Diffusion

G. Grob – 16th GERLI meeting, Bordeaux, France, Deciphering ergosteryl-amino acid synthases’ evolutionary history (26-29/09/2021). Poster

Dr. N. Mahmoudi 16th GERLI meeting, Bordeaux, France, tRNA-dependent lipid modification by aminoacylation in Aspergillus fumigatus (26-29/09/2021). Poster.

N. Yakobov – Présentation orale de la cérémonie de prix de thèse, Société de Biologie de Strasbourg, Strasbourg, France. Discovery of tRNA-dependent ergosterol aminoacylation in fungi (22/04/2021).

N. Yakobov – GERLI 16th International Lipidomics Meeting, Bordeaux, France. Présentation orale de la cérémonie de prix de thèse: RNA-dependent synthesis of 3ß-O-aminoacylated sterols in Fungi (26-29/09/2021).

Pr. H.D. Becker – Polish Academy of Science, Institute of Biochemistry and Biophysics, Warsaw, Poland, Filamentous fungi use aminoacyl-tRNAs to reshape sterols (29/06/2021). Invité à donner un séminaire.

Pr. H.D. Becker – 28th tRNA conference, Colombus, USA, Using aminoacyl-tRNA to conjugate cell wall components in microbes. Conférencier invité (14/06/2022).

Pr. H.D. Becker – Yale Systems Biology Institute, New Haven, USA, RNA-dependent remodeling of cell wall components in microbes. Invité à donner un séminaire (17/06/2022).

Prix

Dr. N. Yakobov, étudiant en thèse travaillant sur le projet depuis le début a obtenu deux prix de thèse décerné par le Groupe d’étude et de recherche en lipidomique (GERLI) et par la Société de Biologie de Strasbourg (SBS) sponsorisé par l’Eurométropole de Strasbourg) en 2021.

M. G. Grob a obtenu le prix du meilleur poster décerné par le GERLI lors du 16th International Lipidomics Meeting (2021)

Le manuscrit du JBC décrivant la découverte de l'Ergosteryl-glycine Synthase a été sélectionné comme choix de l'éditeur du numéro dans lequel le manuscrit a été publié (2022).

Aspergillus fumigatus (Afm) est un champignon pathogène opportuniste responsable d’aspergilloses invasives dont la mortalité, en dépit des traitements, reste très élevée chez les patients immunodéprimés ou atteints de pathologies et/ou de lésions pulmonaires. Comme pour d’autres pathogènes fongiques, l’émergence de résistances aux antifongiques explique en partie ce constat, mais une méconnaissance des aspects moléculaires liés à la pathogénie également. Chez les bactéries pathogènes, où ces mécanismes ont été bien étudiés, on a observé que des enzymes appelées MprF permettent de détourner des acides aminés de la synthèse protéique et de les transférer sur des lipides membranaires, les glycérolipides (GL) ; cette « aminoacylation » des GLs change les propriétés de la membrane cellulaire, augmentant à la fois la résistance aux antibiotiques et l’échappement au système immunitaire. Ce type de modification de membrane n’avait jamais été décrit jusqu’à présent en dehors des bactéries.
Nous avons découvert qu’en réalité, la majorité des champignons supérieurs (Dikarya) sont dotés d’enzymes similaires, que nous avons appelées ErdS, capable de modifier des lipides membranaires avec un acide aminé, l’acide aspartique (Asp). Nous avons montré que, contrairement aux bactéries, les champignons n’utilisent pas l’Asp pour modifier les GLs, mais l’ergostérol (Erg), un lipide essentiel à l’intégrité des membranes, à la pathogénie, la virulence et la résistance des champignons aux antifongiques. L’ergostéryl-aspartate (Erg-Asp) produit est une nouvelle forme de lipide modifié, spécifique des champignons, qui n’avait jamais été détecté auparavant. La fonction de l’Erg-Asp, reste inconnue, mais il est conservé chez de nombreux champignons pathogènes, tels qu’Afm. Par analogie avec les bactéries, nous supposons qu’il pourrait avoir un rôle similaire à ceux des GLs modifiés chez les bactéries : résistance aux antimicrobiens, virulence/pathogénie. Nos résultats préliminaires suggèrent que l’Erg-Asp influence la croissance d’Afm, et qu’il participerait à de nombreux processus moléculaires et cellulaires centraux chez les champignons, tels que la sporulation (conidiation), l'autophagie, le maintien de l'intégrité de la paroi cellulaire, le métabolisme des stérols, etc... L’Erg-Asp pourrait être inclus dans une cascade de signalisation lipidique aboutissant à la modulation de la virulence d'Afm et de la sensibilité aux antimicrobiens.
L’objectif de ce projet de recherche est de déchiffrer le rôle et la (les) fonction(s) de ce nouveau lipide, l’Erg-Asp, et cela en étudiant son rôle dans la physiologie et la virulence d’Afm, y compris des souches cliniques provenant de patients atteints d’aspergilloses, que nous utilisons comme modèle. Comme l’Erg est impliqué dans de nombreux processus de résistance aux antimicrobiens chez les champignons, nous souhaitons étudier l'impact de l’Erg-Asp sur la résistance d'Afm aux antifongiques mais aussi sur sa pathogénie. Nos travaux permettront également une meilleure compréhension de la biologie générale des champignons, dont les pathogènes comme Afm et d’autres opportunistes ayant un impact sur la santé. Ceci pourrait permettre, à plus long terme, d'explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques.