Effecteurs déclenchant la nodulation chez les légumineuses – ET-Nod

Pour répondre aux objectifs du projet ET-Nod, trois tâches ont été proposées :

Tache 1 : Mode d’action d’ErnA et Sup3

Pour identifier les gènes régulés par les ET-Nod ErnA et Sup3, nous avons réalisé des analyses RNA-seq sur des racines transformées de Aeschynomene evenia exprimant ces gènes sous contrôle d’un promoteur inductible. Certains gènes communs induits par ErnA et Sup3 ont été validés par des essais de transactivation chez Nicotiana benthamiana.

La caractérisation du protéome proximal d’ErnA a été réalisée en utilisant une approche de marquage de proximité in vivo (TurboID), avec ErnA fusionné à son extrémité N-terminale à une biotine ligase et produit sous contrôle d’un promoteur inductible. Cette analyse a été conduite à la fois chez N. benthamiana et dans des racines transformées d' A. evenia. Les interactions d’ErnA avec des protéines candidates sélectionnées à partir de cette analyse ont été validées par des essais de complémentation en split-luciférase et de FRET-FLIM.

La conservation des voies de signalisation déclenchées par les effecteurs ET-Nod par rapport à la voie classique dépendante des NF ou à la voie activée par les bradyrhizobia photosynthétiques a été évaluée à l’aide de mutants d' A. evenia pour des gènes symbiotiques clés (générés dans le cadre du projet ANR AeschyNod) et en analysant la capacité de différentes souches de Bradyrhizobium, possédant différents répertoires ET-Nod, à noduler ces lignées mutantes.

Enfin, l’identification de domaines fonctionnels partagés par plusieurs ET-Nod nous a amené à étudier l’interaction d’ErnA et Sup3 avec le SUMOylome de l’hôte, en utilisant des tests de double hybride, des approches de co-immunoprécipitation et de mutagenèse ciblée pour évaluer leur interaction avec des protéines SUMO d' A. evenia.

Tache 2 : Identification de nouveaux effecteurs ET-Nod

Nous avons collecté environ 200 souches de Bradyrhizobium issues de différents continents, dont les génomes étaient séquencés. L’analyse de leur capacité à noduler Aeschynomene indica, combinée à des analyses in silico de leurs effectomes prédits, a permis d’identifier plusieurs souches nodulant A. indica mais dépourvues du gène ernA. Par mutagenèse de gènes candidats et analyse des mutants, nous avons identifié les effecteurs responsables de la nodulation. L’un de ces effecteurs, Sup3, a été validé comme ET-Nod en évaluant sa capacité à induire la formation de pseudo-nodules lorsqu’il est surexprimé dans des racines transformées d’Aeschynomene en l’absence de bactéries.

Tache 3 : Rôle des effecteurs ET-Nod avec des légumineuses cultivées

Sur la base de la collection du Workpackage 2, nous avons sélectionné sept souches de Bradyrhizobium avec différents répertoires ET-Nod. Pour chaque souche, nous avons généré des mutants pour les gènes nod, le T3SS et les ET-Nod identifiés. Les propriétés symbiotiques de ces mutants ont été analysées sur trois espèces cultivées de Vigna (V. unguiculata, V. radiata et V. mungo).

L’analyse d’une collection de Bradyrhizobium a révélé qu’un tiers d’entre elles peut induire la formation de nodules sur A. indica via un mécanisme T3SS dépendant . Douze souches nodulantes dépourvues d' ernA ont permis d’identifier quatre nouveaux gènes ET-Nod incluant : sup3, codant une SUMO-protéase apparentée à Bel2-5, et Ubi1, -2, et –3, probablement impliqués de manière coopérative dans la nodulation. La famille ET-Nod compte désormais six membres, partageant des domaines conservés tels qu’un signal de localisation nucléaire (NLS) ou des motifs liés à la SUMOylation, suggérant un mode d’action commun. Ces travaux révèlent une diversité insoupçonnée de souches capables d’induire la nodulation via divers ET-Nods, soulignant la flexibilité du mécanisme symbiotique T3SS-dépendant (Camuel et al, ISME J, 2023).

Côté plante, certains Bradyrhizobium combinant différents ET-Nods peuvent contourner des gènes symbiotiques considérés essentiels, tels que AePOLLUX, AeCCaMK ou AeCYCLOPS. En revanche, les facteurs de transcription NSP2 et NIN demeurent indispensables à la nodulation (Camuel et al, New Phytol, 2024). L’étude fonctionnelle des domaines SIM et SUMO-protéase d’ErnA et Sup3 a montré leur interaction directe avec les protéines SUMO. La mutation de ces domaines abolit leur capacité à déclencher la nodulation, indiquant que la symbiose T3SS-dépendante est régulée par des modifications post-traductionnelles de type SUMOylation (Fazal et al, New Phytol, 2025).

La caractérisation du proxyome d’ErnA a mis en évidence une interaction avec le complexe Médiator, un acteur central de la régulation transcriptionnelle (Carcagno et al., in preparation). Les analyses RNA-seq ont confirmé que ErnA et Sup3 induisent l’expression de centaines de gènes, dont certains codant différents facteurs de transcription (NFY-C, WRKY, bHLH). Ces données suggèrent que les ET-Nods agissent au sein d’un complexe régulatoire impliquant Mediator pour activer des gènes clés de la nodulation.

Enfin, l’étude de sept souches de Bradyrhizobium portant différents ET-Nods, testées sur trois espèces cultivées de Vigna confirme le rôle essentiel des facteurs Nod (NF), dont la mutation abolit la nodulation. En revanche, la mutation du T3SS entraîne des effets variables selon la souche et l’espèce, pouvant inhiber ou, au contraire, permettre la nodulation. Les mutants ET-Nod n’ont montré aucun effet marqué dans ces symbioses NF-dépendantes. Toutefois, l’analyse de mutants T3E de la souche ORS3257 a révélé que certains effecteurs modulent spécifiquement la symbiose : NopP2 bloque la nodulation chez V. radiata, tandis que NopT et NopAB l’améliorent avec V. mungo et V. unguiculata. D’autres T3Es contenant des domaines SUMO-protéase peuvent inhiber la symbiose avec certaines légumineuses. Ainsi, bien que les ET-Nods n’apparaissent pas jouer de rôle majeur dans les symbioses NF-dépendantes dans les conditions testées, d’autres T3Es agissent comme modulateurs clés de l’efficacité symbiotique.

Le projet ET-Nod a considérablement approfondi notre compréhension de cette famille de protéines. Il a permis d’identifier de nouveaux membres, de révéler leurs interactions avec les protéines SUMOylées et le complexe Médiateur, et de démontrer leur capacité à activer de nombreux gènes végétaux. Ces découvertes suggèrent que les ET-Nods agissent comme des régulateurs centraux des interactions plante–microorganisme. Cependant, leur mode d’action moléculaire reste mal compris, et plusieurs questions clés demeurent ouvertes.

Les prochaines recherches devront identifier les protéines SUMOylées cibles des ET-Nods et déterminer si ceux-ci agissent comme des facteurs de transcription ou comme des régulateurs épigénétiques modulant l’accessibilité de la chromatine et l’activité transcriptionnelle. Ces travaux nécessiteront des approches combinées de biologie cellulaire, de biochimie et génétique pour identifier précisément les mécanismes moléculaires qui sous-tendent leur activité d’induction de la nodulation.

Jusqu’à présent, aucun rôle spécifique des ET-Nod n’a été démontré dans les symbioses dépendantes des facteurs Nod (NF) avec les légumineuses cultivées. Toutefois, cette conclusion reste partielle, car peu de souches et d’espèces hôtes ont été étudiées. L’exploration d’une plus grande diversité de souches de Bradyrhizobium et de légumineuses — notamment le soja, où Bel2-5 peut déclencher la nodulation sans facteurs Nod — pourrait révéler des fonctions plus étendues. La plupart des études ont été réalisées par ailleurs dans des conditions axéniques in vitro, négligeant la complexité des sols et du microbiote. Les ET-Nods pourraient conférer des avantages subtils, dépendants du contexte écologique. Explorer leur rôle dans des conditions plus réalistes permettra de mieux comprendre leur importance écologique et leur contribution à la compétitivité, à la spécificité d’hôte et à l’adaptation bactérienne, offrant ainsi une vision plus intégrée de la communication rhizobium–plante.

Jusqu’ici, les études fonctionnelles conduites ont principalement utilisé des mutants par perte de fonction, offrant une vision incomplète. Les approches futures devraient privilégier des approches de gain de fonction, en combinant différentes variantes d’ET-Nods ou en les exprimant de façon hétérologue pour tester leur redondance et leur synergie. Ces travaux bénéficieront du développement de nouveaux outils génétiques, notamment des vecteurs navettes RepABC stables dans Bradyrhizobium et E. coli.

Ces recherches établiront un cadre mécanistique et évolutif pour les ET-Nods, précisant leur rôle dans la symbiose et leur potentiel pour une agriculture durable. Comprendre comment ces effecteurs influencent les réseaux transcriptionnels et épigénétiques de l’hôte permettra de mieux exploiter la fixation biologique de l’azote et d’améliorer la productivité des légumineuses, tout en réduisant la dépendance aux engrais chimiques et l’impact environnemental.

• Busset N, Gully D, Teulet A, Fardoux J, Camuel A, Cornu D, Severac D, Giraud E, Mergaert P. (2021) The Type III Effectome of the Symbiotic Bradyrhizobium vignae Strain ORS3257. Biomolecules. 11(11):1592. doi: 10.3390/biom11111592.
• Teulet A, Camuel A, Perret X, Giraud E. (2022) The Versatile Roles of Type III Secretion Systems in Rhizobia-Legume Symbioses. Annu Rev Microbiol. 2022 Apr 8. doi: 10.1146/annurev-micro-041020-032624.
• Songwattana P, Chaintreuil C, Wongdee J, Teulet A, Mbaye M, Piromyou P, Gully D, Fardoux J, Zoumman AMA, Camuel A, Tittabutr P, Teaumroong N, Giraud E. (2021) Identification of type III effectors modulating the symbiotic properties of Bradyrhizobium vignae strain ORS3257 with various Vigna species. Sci Rep. 11(1):3266. doi: 10.1038/s41598-021-82751-x.
• Tighilt L, Boulila F, De Sousa BFS, Giraud E, Ruiz-Argüeso T, Palacios JM, Imperial J, Rey L. (2021)The Bradyrhizobium Sp. LmicA16 Type VI Secretion System Is Required for Efficient Nodulation of Lupinus Spp. Microb Ecol. 2021 Oct 25. doi: 10.1007/s00248-021-01892-8. Online ahead of print.
• Nouwen N, Chaintreuil C, Fardoux J, Giraud E. (2021) A glutamate synthase mutant of Bradyrhizobium sp. strain ORS285 is unable to induce nodules on Nod factor-independent Aeschynomene species. Sci Rep. 2021 Oct 22;11(1):20910. doi: 10.1038/s41598-021-00480-7.
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Les légumineuses jouent un rôle agronomique et écologique majeur en raison de leur capacité à fixer l'azote atmosphérique lors de la symbiose avec les rhizobia. Les principales cultures de légumineuses sont des espèces tropicales (soja, arachide, niébé ...) qui représentent plus de 85% de la production de légumineuses à graines. Ces espèces sont toutes nodulées par des souches de Bradyrhizobium qui contiennent des gènes de nodulation (gènes nod) nécessaires à la synthèse de signaux symbiotiques clés, appelés facteurs Nod (FN), mais aussi des gènes T3SS qui codent pour le Système de Sécrétion de Type 3 (T3SS). Le T3SS, initialement identifié chez des pathogènes bactériens animaux et végétaux, permet l’injection de protéines effectrices à l'intérieur des cellules hôtes pour favoriser l’infection en interférant avec divers processus de l'hôte, notamment la suppression des réponses immunitaires. Pendant longtemps, il a été supposé que la nodulation reposait absolument sur les FNs pour déclencher l'organogenèse des nodules et l'infection. La machinerie T3SS, en revanche, était considérée comme un équipement accessoire modulant l’efficience et le spectre d’hôte de la bactérie. Cependant, il a été démontré que certaines espèces de légumineuses du genre Aeschynomene mais aussi le cultivar Glycine max cv. Enrie sont nodulées par des souches de Bradyrhizobium en l'absence de synthèse de FNs. Dans ce cas, l'établissement de l'interaction nécessite que la bactérie possède un T3SS fonctionnel, ce qui indique que des effecteurs spécifiques de Type 3 peuvent activer directement la voie de signalisation de la nodulation chez les légumineuses, en contournant la perception des FNs.
Nous avons démontré récemment que chez la souche de Bradyrhizobium ORS3257, cette symbiose dépendante du T3SS repose sur un cocktail d'au moins cinq effecteurs jouant des rôles synergiques et complémentaires dans l'organogenèse des nodules, l'infection et la répression de la réponse immunitaire de la plante. Parmi eux, nous avons identifié l'effecteur nucléaire ErnA, très conservé chez les bradyrhizobia, comme un acteur clé de l'organogenèse des nodules. En outre, les données préliminaires indiquent que d'autres souches de Bradyrhizobium peuvent utiliser d'autres effecteurs de type 3, distincts d’ErnA, pour déclencher la nodulation.
Notre découverte récente qu'une seule protéine effectrice suffit à induire l'organogenèse des nodules sans avoir besoin de FNs est un changement de paradigme dans le domaine et indique que les programmes de nodulation des légumineuses ne sont pas exclusivement contrôlés par les FNs.
Nos principaux objectifs dans le cadre du projet ET-Nod sont : i) de déchiffrer les mécanismes moléculaires par lesquels ErnA active la nodulation chez Aeschynomene, ii) d'identifier de nouveaux effecteurs (appelés ET-Nods) se comportant comme ErnA dans le déclenchement de la nodulation et iii) de caractériser l'importance de cette famille d'effecteurs dans l'efficacité symbiotique des légumineuses d'intérêt agronomique.
À cette fin, notre consortium, auquel participent des spécialistes de la symbiose végétale et de la pathogenèse, i) combinera des approches biochimiques, génétiques et omiques pour caractériser les cibles moléculaires d'ErnA (nucléiques et protéiques), ii) développera chez le genre Bradyrhizobium une analyse génomique comparative couplée à une approche de mutagenèse pour identifier de nouveaux effecteurs ET-Nod et iii) étudiera par des approches de génétique, le rôle joué par les effecteurs ErnA et ET-Nod dans différentes souches de Bradyrhizobium lors de symbioses avec des légumineuses cultivées (soja, arachide, niébé …).
Les connaissances acquises au cours de ce projet pourraient être exploitées en agronomie pour améliorer le rendement de plusieurs légumineuses cultivées et pour concevoir de nouvelles stratégies visant à transférer la capacité symbiotique fixatrice d'azote aux céréales.