Comment la communication de cellule à cellule régule-t'elle la croissance du fruit ? – 3C-FruitGrowth

Afin de comprendre le rôle de FW2.2 dans la régulation de la croissance du fruit, la Tâche 1 vise à caractériser des plantes de tomates modifiées pour surexprimer FW2.2 (OE) et des plantes perte-de-fonction (KO), à l'aide d'approches morphométriques, cytologiques et histologiques pour étudier la taille des fruits et du péricarpe, la taille et le nombre des cellules dans le péricarpe. Nous étudierons ensuite l'impact de la perturbation de l’expression de FW2.2 au niveau moléculaire en analysant les changements transcriptionnels à l'échelle du génome se produisant chez les fruits des plantes OE/KO.
La Tâche 2 vise à étudier la fonction cellulaire de FW2.2 dans la signalisation de cellule à cellule via les PD, par des approches d’imagerie confocale sur des sections de péricarpe de tomate de fruits exprimant FW2.2 fusionnée à la YFP pour étudier sa localisation et sa distribution cellulaire au PD. Le co-marquage avec le PD sera réalisé en utilisant le bleu d'aniline, colorant marquant la callose pour révéler les PD. Nous utiliserons des approches d'immunofluorescence sur des coupes de péricarpe avec des anticorps anti-YFP, anti-callose et anti-PDCB1 (marqueur des PD). Nous évaluerons l'impact de la modification d’expression de FW2.2 (OE/KO) sur le mouvement de cellule à cellule de la GFP cytosolique comme contrôle ou d’un inhibiteur du cycle cellulaire, KRP fusionné à la GFP, après co-transformation par biolistique. Nous quantifierons le niveau de dépôt de callose au PD dans le péricarpe des fruits sauvage et mutants (OE/KO), par coloration au bleu d'aniline et immunomarquage. Afin d’identifier les partenaires protéiques de FW2.2, le système de split-ubiquitine membranaire en double hybride chez la levure (MYTH) sera utilisé pour cibler des protéines connues localisées au PD, mais aussi pour cibler des régulateurs du cycle cellulaire. En parallèle, nous utiliserons une approche in planta non ciblée pour identifier de nouveaux interacteurs de FW2.2 par co-immunoprécipitation.
La tâche 3 vise à établir le lien entre la régulation transcriptionnelle de FW2.2 et son rôle dans la croissance des organes, en utilisant la génétique et des approches moléculaires. Par des approches de cartographie QTL et eQTL dans une population de tomate en ségrégation, l'architecture génétique des polymorphismes dans la région promotrice de FW2.2 et de son expression, et celles des gènes co-régulés seront déterminées afin de relier ce réseau de gènes à la variation de la taille des fruits. Nous détaillerons l'expression spatiale et temporelle de FW2.2 en étudiant des lignées rapportrices GUS du promoteur natif FW2.2 d'Ailsa Craig (lignée cultivée de S. lycopersicum avec «l’allèle gros fruits«) et de l'ancêtre de la tomate S. pimpinellifolium (allèle «petits fruits«). Les informations sur les QTL seront utilisées pour générer des promoteurs mutés qui seront testés in planta pour leur effet sur l'expression de FW2.2 et la conséquence sur la croissance des fruits.

Pour réaliser l’analyse fonctionnelle du gène FW2.2 (Tâche 1), des plantes « gain-de-fonction » en génération T2 pour la surexpression du gène ont été obtenues : 35S::FW2.2 , ainsi que les plantes « perte-de fonction » pour le « silencing » du gène (par RNAi et CRISPR-Cas9) : 35S::RNAi-FW2.2 et CR-fw2.2. Le phénotypage des plantes obtenues a été initié, et a permis de montrer que les lignées de surexpression 35S::FW2.2 étaient affectées dans leur développement végétatif, affichant une hauteur de plante inférieure, alors les lignées de perte de fonction 35S::RNAi-FW2.2 ne présentaient aucun phénotype lié à la croissance de la plante entière. Dans les lignées 35S::FW2.2, nous avons observé une réduction de la surface foliaire moyenne chez toutes les plantes (de 33 % à 42 %), tandis que dans les plantes perte de fonction 35S::RNAi-FW2.2 et CR-fw2.2, aucun phénotype clair n'a été observé, ce qui est conforme à l'absence d'expression de FW2.2 dans les feuilles. Une réduction significative de 19,6 % du poids moyen des fruits a été observée dans une seule lignée 35S::FW2.2-2, alors qu'aucun effet n'a été observé dans les plantes perte de fonction. Par rapport au WT, les fruits des plantes 35S::FW2.2 et 35S::RNAi-FW2.2 ne présentaient aucune modification de l'épaisseur du péricarpe, tandis que le péricarpe des fruits CR-fw2.2 était plus fin.
Pour résumer, bien que les niveaux d'expression de FW2.2 aient été considérablement modifiés dans les plantes perte- et gain de fonction, ces modifications n'ont pas entraîné de défauts profonds sur la croissance et le développement des plantes, à l'exception d'une diminution de la surface foliaire lorsque FW2.2 était surexprimé. Seul un léger effet sur la masse des fruits a été signalé. Cette absence de corrélation directe entre le niveau d'expression de FW2.2 et la taille des fruits est inattendue, et suggère que les mécanismes par lesquels FW2.2 exerce ses effets sur la croissance des fruits sont vraisemblablement plus subtils, nécessitant un mode d'expression très spécifique.
Pour approfondir l'étude de la localisation sub-cellulaire de FW2.2 (Tâche 2), nous avons utilisé des lignées transgéniques surexprimant FW2.2 fusionné à l’EYFP (35S::FW2.2-EYFP). Par imagerie confocale, nous avons pu montrer que FW2.2 est localisée à la membrane plasmique des cellules de racines, de péricarpe de fruit et de feuilles de tomate. Cette localisation se fait au niveau de ponctuations à la périphérie cellulaire, suggérant que FW2.2 est enrichi au niveau de microdomaines. Une coloration au bleu d'aniline pour révéler le dépôt de callose au niveau des PD a ainsi montré une parfaite co-localisation avec le signal FW2.2-EYFP, confirmant ainsi la localisation de FW2.2 au niveau des PD. Nous avons ensuite quantifié l’indice PD pour mesurer l'enrichissement de FW2.2 au niveau des PD. L'indice PD de la FW2.2-EYFP est supérieur à 1,7, dans les racines et le péricarpe des fruits, démontrant ainsi que FW2.2 est en effet enrichi au PD.

Ayant confirmé la localisation de FW2.2 au PD, nous allons évaluer l'impact de la modification d’expression de FW2.2 (OE/KO) sur la fonctionnalité du PD en mesurant le dépôt de callose qui régule l’ouverture des PD, et sur le mouvement de cellule à cellule de molécules marqueurs.
L’identification de partenaires protéiques de FW2.2 sera entreprise, pour déterminer le réseau protéique d’interaction de FW2.2 au niveau du PD.
L’établissement du lien entre la régulation transcriptionnelle de FW2.2 et son dans le contrôle de la croissance par des approches génétiques et moléculaires va être entreprise dans la deuxième moitié du projet. Dans un premier temps, l’analyse de l’expression spatio-temporelle de FW2.2 sera rapidement réalisée grâce à l’obtention de différentes plantes transgéniques exprimant les constructions rapportrices du GUS-GFP suivantes : pFW2.2-Slyc::GUS-GFP, pFW2.2-Spen::GUS-GFP, pFW2.2-Spim::GUS-GFP, respectivement contenant le promoteur du gène FW2.2 de Solanum lycopersicum var. Ailsa Craig (correspondant à l’allèle ”gros fruit”), de Solanum pennelli (tomate sauvage, ancêtre de S. lycopersicum, correspondant à l’allèle ”petit fruit”) et de Solanum pimpinellifolium (tomate sauvage, ancêtre de S. lycopersicum, correspondant à l’allèle ”petit fruit”) pour contrôler l’expression couplée des gènes GUS et GFP.

Arthur Beauchet, Frédéric Gévaudant, Nathalie Gonzalez, Christian Chevalier*. (2021). In search of the still unknown function of FW2.2 / CELL NUMBER REGULATOR, a major regulator of fruit size in tomato. Journal of Experimental Botany, 72: 5300-5311 ?10.1093/jxb/erab207) (hal-03239239?.

Le gène FW2.2 est associé au QTL majeur qui gouverne la taille du fruit chez la tomate. FW2.2 appartient à une famille multigénique et code pour une protéine transmembranaire qui agit négativement dans le contrôle de la division cellulaire au cours du développement du fruit. A ce jour les mécanismes moléculaires de l'action FW2.2 restent inconnus. En particulier, comment FW2.2 fonctionne pour réguler le cycle cellulaire et la croissance et la taille du fruit n’est toujours pas compris. Les données récentes issues des Partenaires 1 et 3 montrent de façon inattendue que FW2.2 s'associe à des canaux intercellulaires, les plasmodesmes (PD) (données non publiées), ce qui suggère un rôle de FW2.2 dans le trafic de cellule-cellule. Les données de la littérature établissent également un lien entre le transport de régulateurs du cycle cellulaire ou de facteurs de transcription médié par les PDs et la différenciation cellulaire et la croissance d'organe.
Dans ce contexte, le projet 3C-FruitGrowth a pour but de déchiffrer les mécanismes moléculaires par lesquels FW2.2 fonctionne pour réguler la taille des organes, en prenant le fruit de tomate comme système modèle. Ce projet est basé sur l'hypothèse originale selon laquelle FW2.2 fonctionne au niveau des PD et régule le mouvement de cellule-cellule de régulateurs de cycle cellulaire clés. Ce mécanisme contribuerait alors à contrôler spatialement la division cellulaire et/ou le mécanisme d'expansion de la cellule par endoreduplication, ce qui influerait finalement la taille du fruit. Puisque FW2.2 appartient à une famille multigènique, ce projet vise également à étudier le rôle des membres de la famille CELL NUMBER REGULATOR (CNR) dans la régulation de la croissance.
Pour déterminer le mode d'action des protéines FW2.2 et CNR dans la croissance des plantes, nous visons à répondre aux questions biologiques suivantes: (1) Comment les gènes FW2.2 et CNR affectent-ils la division cellulaire et la croissance des organes? (2) FW2.2 et CNR sont-ils impliqués dans la signalisation de cellule-cellule via les PDs? (3) Quel est le rôle des polymorphismes génétiques présents dans les gènes CNR, dans les gènes codant pour les protéines interagissant avec FW2.2 et les gènes liés au cycle cellulaire dans la variation de la taille du fruit, et qu’est-ce qui détermine leur expression? Notre programme de recherche intégré vise à faire la lumière sur un mode de contrôle encore inconnu de la taille des organes, à savoir le rôle de la signalisation de cellule-cellule dans la détermination de la taille du fruit chez la tomate.
En tant que protéine spécifique de la plante, FW2.2 est présente dans les espèces d'importance agronomique, les dicotylédones (par exemple la tomate, le fruit le plus produit dans le monde, mais aussi dans d'autres espèces de fruits) et les monocotylédones (par exemple le maïs, dans laquelle un homologue de FW2.2 régule la hauteur des plantes, mais aussi la taille de épis). La compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels la famille des gènes FW2.2 agit pour contrôler la taille des fruits et donc sur le rendement de la plante, aidera à la sélection de nouvelles variétés d’intérêt agronomique.