Signature moléculaire de l'activation des convertases dans les glomérulopathies complément dépendentes – COMSIGN

Patients:

Les prélèvements utilisés dans cette études sont des prélèvements sanguins (plasma EDTA) et tissulaires rénaux (biopsies rénales) réalisés chez des patients français porteurs de Glomérulopathie à dépôts de C3, collectés dans le cadre du soins (enregistrement CNIL 199223 et CPP du service d'immunologie HEGP). Pour tous ces patients, une recherche exhaustive des anomalies acquises (C3Nef, Anticorps anti-Facteur H, Anticorps anti-C3b et Ac anti-FB, recherche de gammapathie monoclonale (GM) ainsi qu’une étude d’un panel de gènes du complément impliqués dans la maladie a été réalisé dans le cadre du diagnostic étiologique de la maladie. Les données cliniques au diagnostiques, au cours du suivi et au dernier suivi ont été recueillis. Les biopsies rénales des patients ont été relues de façon centralisées par deux anatomopathologistes différents afin de réaliser le score d'activité et de chronicité des lésions histologiques.

Méthodes

1/ Caractérisation du profil d’activation des convertases systémiques et intra-rénales et corrélation immuno-clinique

A- Étude détaillée des biomarqueurs plasmatiques d’activation du des convertases

dosage de 11 protéines de la cascade du complément (C3 et C4 intacts, fragments de clivages C3a, Ba, Bb, C4a, C5a, sC5b9, et régulateurs FH et FI par ELISA multiplex, properdine par ELISA). B-Étude de l’activation tissulaire intra rénale des C3/C5 convertase et son impact sur le phénotype de la GC3. Deux stratégies d'évaluation des convertases in situ sont envisagées : l'étude de la proximité du C3b et du Bb, témoin de la formation de la C3 convertases (technique Duolink) et du marquage C5b-9 (technique IHC) témoin de l’activité de la C5 convertase. Les 1er résultats acquis concernent le marquage C5b-9.

2/ Caractérisation de la réponse immunitaire intra-rénale en lien avec l’activation du complément

A-Caractérisation des populations immunitaires intra rénales

Étude de l’infiltrat inflammatoire intra rénal médié par les anaphylatoxines grâce au marquage multiplex des populations immunitaires couplées aux marquages des récepteurs aux anaphylatoxines : CD34, CD45, CD66b, CD20, CD3, CD68, C3aR, C5aR1 par technique Opal.

B-Profile transcriptomique de la réponse immunitaire.

Une 1ère étude transcriptomique portant sur 800 gènes de l'immunité a été réalisée à partir de 36 biopsies de patients GC3 par technologie Nanostring suivie d'une deuxième étude de transcriptomique spatiale par technologie GeoMix chez 12 patients.

1/ Caractérisation du profil d’activation des convertases systémiques et intra-rénales et corrélation immuno-clinique

A-Étude détaillée des biomarqueurs plasmatiques d’activation du des convertases:

Une analyse en cluster non supervisée m’a permis d’identifier trois groupes de patients qui se distinguent par des profils de biomarqueurs différents : un premier groupe caractérisé par une activation majeure des VA et VFC, le second par une activation dissociée des VA et VFC et le dernier par une élévation plus modérée et hétérogène des fragments de clivage des C3 et C5 convertases (Ba, C3a et/ou sC5b-9). Ces résultats ont été confrontés aux anomalies acquises responsables de l'activation de la VA : de façon intéressante, la fréquence des GM et/ou anomalies acquises vis-à-vis des protéines du complément est plus élevée dans les deux premiers groupes (16/23 (70%) et 9/11 (82%) respectivement contre 5/21 (24%), p=0,0012), suggérant des mécanismes et un niveau d’activité des C3 et C5 convertases différents selon les anomalies acquises.

B-Étude de l’activation tissulaire intra rénale des C3/C5 convertase et son impact sur le phénotype de la GC3

un marquage C5b-9 glomérulaire est mis en évidence dans près de 90% des biopsies analysées. Le score des dépôts de C5b-9 (faible à intense) corrèle avec les scores d'activité et de chronicité histologique des biopsies et à la survie rénale.

2/ Caractérisation de la réponse immunitaire intra-rénale en lien avec l’activation du complément

A- Caractérisation des populations immunitaires intra rénales: nous avons identifié une compartimentalisation de l'infiltrat immunitaire au sein des biopsies. Dans l'interstitium, les macrophages et les lymphocytes T constituent les populations immunes majoritaires suivie des lymphocytes B alors que dans les glomérules, les PNN et macrophages sont prédominantes. Nous avons identifié une corrélation entre l'importance de l'infiltration glomérulaire par les PNN et les profiles d'activation des convertase C3 et C5 , de même qu'avec l'expression phénotypique de la maladie (âge au diagnostic, degré de protéinurie) mais aussi au score histologique en particulier le score d'activité et avec la réponse au traitement immunosuppresseur et à la survie rénale. A l'inverse la présence d'un infiltrat immunitaire interstitiel est associé à un âge plus avancé au diagnostic, une moins bonne fonction rénale, un score histologique de chronicité, une moins bonne réponse au traitement et une survie rénale moins bonne.

B- Profile transcriptomique de la réponse immunitaire: les données de transcriptomique spatiale au sein des glomérules permettent d'identifier une signature d'activation des cellules mésangiales chez les biopsies riches en PNN exprimant le C5aR. Dans l'interstitium, il existe une signature pro fibrosante et de transition épithéliomésenchymateuse dans les biopsies infiltrées par des cellules immunitaires dans l'interstitium.

Les résultats de ce travail ouvrent plusieurs perspectives prometteuses tant sur le plan physiopathologique que translationnel. L’analyse fine des mécanismes d’activation des convertases C3 et C5 dans la glomérulopathie à dépôts de C3 a mis en évidence des profils d’activation distincts, traduisant une hétérogénéité fonctionnelle entre les patients. Cette diversité pourrait refléter des sous-types de la maladie, guidés par des déséquilibres spécifiques dans la régulation des convertases, et justifier une stratification personnalisée des patients. Une première perspective est donc de valider ces profils dans une cohorte indépendante et bien phénotypée, en les corrélant à des critères histologiques, biologiques et évolutifs, afin d’en évaluer la robustesse pronostique et leur utilité pour la décision thérapeutique.

Par ailleurs, l’identification de conséquences immunitaires spécifiques associées à l’activation persistante des convertases – telles qu’une infiltration locale de certaines sous-populations lymphocytaires, l’induction de voies inflammatoires intra-rénales suggère que le complément ne se limite pas à un rôle d’amplificateur de l’inflammation, mais agit aussi comme modulateur de la réponse immunitaire adaptative locale. Cela ouvre une seconde voie de recherche visant à caractériser les cellules immunitaires intrarénales impliquées et à décrypter les voies de signalisation activées en réponse à la dérégulation du complément. L’utilisation de techniques telles que la cytométrie de masse, le single-cell RNA sequencing ou l’imagerie multiplexée pourrait permettre d’approfondir cette analyse à haute résolution.

Enfin, ces travaux soulignent l’intérêt de développer des biomarqueurs fonctionnels reflétant l’activité des convertases C3 et C5 in situ, qui pourraient constituer des outils innovants pour le suivi de l’activité de la maladie et la réponse aux traitements ciblés du complément. À terme, cette approche pourrait permettre d’identifier les patients les plus susceptibles de répondre aux inhibiteurs du complément (C3, C5, facteur B, etc.), d’optimiser leur utilisation, et d’envisager des stratégies combinées pour mieux contrôler l’inflammation et prévenir la progression vers la maladie rénale chronique

La cascade du complément appartient à la réponse immunitaire innée anti bactérienne mais joue aussi un rôle important dans l’homéostasie cellulaire et la mise en place d’une réponse immunitaire adaptative. Des données croissantes sont en faveur de l’implication du complément dans la physiopathologie de nombreuses pathologies rénales, en particulier auto-immunes. Parmi ces maladies, la glomérulopathie à dépôts de C3 (GC3) est devenue le prototype de la maladie liée à une activation non contrôlée des 2 enzymes clé de la voie alterne (VA), la C3 et la C5 convertases. La GC3 est très majoritairement acquise, liée à la présence d’un C3NeF, un auto anticorps (Ac) liant la C3 convertase. La GC3 est rare, touche le plus souvent les enfants ou adultes jeunes avec un sex ratio équilibré. Après l’âge de 50 ans, la GC3 est associée dans 65% des cas à la présence d’une Immunoglobuline (Ig) monoclonale, dont il a pu être démontré par le PI la capacité à activer directement la VA indépendamment d’une activité auto Ac. Le pronostic rénal est globalement sévère en l’absence de traitement efficace connu. La médiane de survie rénale est de 8-10 ans. De plus, il n’existe actuellement aucun biomarqueur spécifique permettant de prédire l’évolution rénale. Sur le plan histologique, les dépôts glomérulaires de C3, pathognomoniques, sont associés à une inflammation intra rénale de degré variable, corrélée à la sévérité rénale.
Des travaux préliminaires du PI, suggèrent que le C3NeF pourrait moduler l’équilibre entre l’activité de la C3 et/ou C5 convertase. Il a été en outre démontré que que l’équilibre des convertases est corrélé à la survie rénale. Enfin, une étude transcriptomique rénal a permis d’identifier 5 profils différents de réponse immunitaire intra rénale, corrélés au pronostic rénal. Nous faisons l’hypothèse que les propriétés physico-chimiques des Ig, ont un effet sur l’équilibre d’activation des 2 convertase, indépendamment d’une activité autoanticorps. Par la réponse immunitaire qu’elle induirait, la modulation de cet équilibre constituerait un facteur pronostic majeur pour la survie rénale.
Grâce à une collaboration étroite avec les centres de néphrologie de France, l’équipe a constitué l’un des cohortes les plus importante au monde et dispose de plasma plus de 150 patients avec ainsi que les biopsies rénales de 82 patients ainsi que les données cliniques des patients.
Notre objectif est 1) de comprendre, à l’aide modèles d’activation du complément, les mécanismes moléculaires fins de l’équilibre d’activation de la C3/C5 convertase en présence d’Ig polyclonales ou monoclonale afin d’identifier des biomarqueurs sanguins (dosage ELISA de fragments d’activation), tissulaires (marquage en IF et IHC des protéines du complément) et urinaires (spectrométrie) témoins de cet équilibre 2) de déterminer la signature moléculaire sanguine (immunophénotypqage lymphocytaire périphérique par cytométrie de flux) et rénale (transcriptomique et immuno-marquage) de la réponse immunitaires secondaire à l’activation de la VA afin de corréler au pronostic rénal et enfin 3) de déterminer les propriétés physico chimiques des Ig impliquées dans le déterminisme de l’activation des convertases. Nous utiliserons comme contrôle des Ig purifiées de sujets sains appariés sur le sexe.
L'identification de biomarqueurs fins de l’activation du complément et de la signature moléculaire de la réponse immunitaire secondaire permettra d’établir un « immunoscore » afin 1) d’établir le pronostic rénal des patients 2) d’adapter au mieux la prescription des traitements immunosuppresseurs (anti-cellules B, anti- cellules T..) ou des bloqueurs du complément actuellement en cours de développement 3) d’étendre le concept d’immunoscore à d’autres pathologies rénales complément médiées afin d’améliorer la compréhension du rôle du complément dans leur physiopathologie et d’établir la place des nouveaux bloqueurs du complément dans ces autres indications.