Définir le rôle du peptide RFRP3 par édition du génome. – GMO-Phen

1/ Utiliser la méthodologie CRISPR-Cas9 pour invalider le gène Npvf, qui code pour le peptide RFRP3 (impliqué dans la reproduction saisonnée), chez le mouton et le hamster, deux espèces à reproduction saisonnée (reproducteurs de jours courts et de jours longs, respectivement).
2/ Effectuer un phénotypage endocrine/comportemental des animaux ainsi générés afin de tester l’impact de la délétion sur la saisonnalité de la reproduction.
3/ Développer et utiliser la méthodologie de single cell RNAseq (scRNAseq) pour obtenir une caractérisation moléculaire fine des neurones Npvf chez le mouton et le hamster, avec comme hypothèse de travail qu’une différence de neurotransmetteur (activateur/inhibiteur) pourrait expliquer les phénotypes saisonniers opposés de la reproduction (aussi appelée phénologie).

1/ La génération de moutons transgénique était prévue sur deux saisons de reproduction consécutives : 2021-2022 et 2022-2023. Il s’agissait de faire chaque année 5 expériences similaires impliquant chacune 6 brebis donneuses d’ovocytes fécondés (protocole de super-ovulation) et 6 brebis receveuses d’ovocytes fécondés et édités par CRISPR-Cas9 (de 1 à 3 ovocytes réimplantés/brebis). Les expériences de l’année 1 se sont déroulées conformément au plan prévu, entre Septembre 2021 et Février 2022. Sur les 30 brebis receveuses, 6 ont été gestantes (sur 4 expériences différentes) donnant naissance à 7 agneaux (une naissance gémellaire). 3 de ces agneaux – 1 mâle et 2 femelles ; fondateurs – sont porteurs d’au moins un allèle Npvf édité. Ce résultat est encourageant et démontre que notre approche est fonctionnelle. Nous avons déjà entamé les expériences de l’année 2 en modifiant l’approche par gRNA (1 seul guide au lieu de 2) et nous espérons obtenir un mâle dont les deux allèles seraient édités, afin de pouvoir établir une lignée. Les animaux déjà obtenus devraient permettre de fournir quelques réponses préliminaires. Concernant les hamsters, la méthodologie s’avère plus difficile à mettre en œuvre que prévue et malgré les différentes tentatives, aucune gestation (d’ovocytes non édités) n’a été obtenue bien que nos méthodes de prélèvement et de mise en culture permettent d’obtenir de jeunes blastocystes. Les mises au point se poursuivent et un changement de l’approche méthodologique (électroporation in vivo, méthode dite GONAD déjà utilisée chez la souris et le rat) est en discussion.
2/ Le phénotypage des animaux édités nécessite d’AVOIR les animaux édités – cette partie du projet est donc encore en devenir.
3/ Une manip pilote de scRNAseq a été effectuée chez le mouton entre juin et octobre 2022. Cette expérience a été riche d’enseignements, en partie compatibles avec ceux de la littérature : les neurones sont peu nombreux dans notre structure d’intérêt et leur structure (longs prolongements, axones et dendrites) les rend très fragiles au processus de dissociation. Le résultat de scRNAseq est tout à fait exploitable – démontrant notre capacité à faire la procédure – mais indique clairement que seules les cellules gliales sont présentes dans notre échantillon. Nous avons donc décidé de passer au single nuclei RNAseq (snRNAseq) qui devrait permettre de lever cette limitation. Les mises au point ont eu lieu entre Février et Juin 2022 et la 1ère manip complète est planifié pour la fin du mois de Novembre. Si cette méthodologie s’avère payante, elle sera appliquée aux échantillons issus de hamsters dès 2023 (prélèvements planifiés pour la fin d’année).

Les adaptations méthodologiques devraient nous permettre d’obtenir d’autres moutons avec édition du gène Npvf, nécessaires pour établir une lignée (hors du pas temporel de ce projet). Le développement du snRNAseq en lieu et place du scRNAseq devrait nous donner accès au transcriptome saisonnier de ces neurones chez le mouton et le hamster, ce qui nous permettra de tester directement notre hypothèse d’un phénotype neurochimique opposé entre mouton et hamster.

Publications dans des revues à comité de lecture grâce au soutien de l’ANR :
1. Dardente & Simonneaux. Journal of Neuroendocrinology, 34 (4): e13124, 2022. doi: 10.1111/jne.13124
2. Dardente et al. Journal of Neuroendocrinology, 34 (10): e13198, 2022. doi: 10.1111/jne.13198
3. Angelopoulou E, Kalsbeek A, Simonneaux V. Age-dependent change of RFRP-3neuron numbers and innervation in female mice. Neuropeptides. 92: 102224. 2022 doi: 10.1016/
4. Angelopoulou E, Inquimbert P, Klosen P, Anderson G, Kalsbeek A, Simonneaux V. ;Daily and Estral Regulation of RFRP-3 Neurons in the Female Mice. J Circadian Rhythms 19:4. 2021. doi: 10.5334/jcr.212.

La reproduction saisonnière est une réponse adaptative cruciale pour faire face aux changements environnementaux annuels. Afin de permettre la naissance des petits aux printemps, les espèces se reproduisent durant le printemps (gestation courte, hamster) ou durant l’automne (gestation longue, mouton). Nos travaux ont identifié un rôle important pour deux peptides hypothalamiques dans le contrôle de la saisonnalité: RFRP3 (RF-amide Related Peptide 3) et KISS1 (Kisspeptin). Le rôle de RFRP3 demeure énigmatique mais nos résultats suggèrent qu’il joue un rôle clé dans la régulation temporelle de la saisonnalité, probablement via KISS1. Nous allons donc invalider ce gène chez le mouton et le hamster, définir l’ensemble des gènes exprimés par les neurones RFRP3 ainsi que les relations entre neurones RFRP3 et KISS1. Ces études clarifieront le rôle potentiel de RFRP3 dans le circuit qui régule la reproduction saisonnière.