Rôle des ARN régulateurs dans l’adaptation de Staphylococcus aureus aux stratégies immunitaires dépendantes des métaux – MetalAureus

Afin d'identifier et de caractériser les ARN régulateurs de S. aureus impliqués dans l'homéostasie des métaux, nous avons développé une approche de séquençage à haut débit ciblant les ARN de 80 à 300 nucléotides. Grâce à une combinaison d'approches expérimentales, telles que le MAPS (« MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing »), et de prédictions in silico, nous avons pu révéler l'interactome de ces ARN régulateurs. Nous avons ensuite utilisé diverses méthodes de microbiologie, de biologie moléculaire et de biochimie pour caractériser leurs rôles respectifs dans la survie et la virulence de S. aureus.

Dans un premier temps, ces travaux ont été réalisés dans des conditions de croissance contrôlées, ce qui a permis de disséquer les réponses de S. aureus au stress métal-dépendant et de faciliter la transition vers des conditions plus physiologiques et donc plus complexes. Par la suite, les stratégies de défense de l'hôte basées sur les métaux et les contre-mesures de S. aureus ont été examinées en présence d'effecteurs (calprotectine), de cellules immunitaires (macrophages), mais aussi au sein de l'hôte (modèle murin). Pour cela, nous avons notamment établi la méthode de « Dual RNA sequencing » qui permet de mesurer simultanément l'expression génétique de S. aureus et des cellules de l'hôte.

Grâce à une approche de séquençage d'ARN avec sélection de taille, nous avons pu identifier plusieurs ARN régulateurs dont l'expression est induite ou réprimée en réponse à différents types de stress, incluant la carence et l'excès de métal.

IsrR est l'analogue fonctionnel de l'ARN régulateur RyhB identifié chez E. coli. Tout comme RyhB, la production d'IsrR est réprimée par le facteur de transcription Fur en présence de fer. En collaboration avec le Dr. Jeffrey Boyd (The State University of New Jersey - USA), nous avons montré que IsrR réprime l'expression de nombreuses enzymes fer-dépendantes impliquées dans le cycle de Krebs, en réponse à une carence en fer. Ainsi, IsrR réduit la demande intracellulaire en fer et permet sa remobilisation. Le maintien de l'homéostasie du fer par IsrR est notamment crucial pour la virulence de S. aureus.

Nous avons également identifié une interaction sans précédent entre IsrR et le riborégulateur Mn-dépendant mnrS permettant d'ajuster finement l'expression du gène mntY, codant pour une pompe à efflux de Mn. Fait remarquable, la délétion de mntY induit d'importants défauts de croissance, diminue l'expression de facteurs de virulence et affecte drastiquement l'évasion immunitaire et la survie de S. aureus durant l'infection. Nous avons démontré que MntY est essentielle pour l'adaptation de S. aureus à des environnements contenant peu ou trop de manganèse, en raison de son double rôle dans la métalation des exoenzymes Mn-dépendantes et dans la détoxification de ce dernier. Ainsi, nos découvertes indiquent que MntY est une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour lutter contre les infections à staphylocoques.

De plus, nous avons caractérisé pour la première fois chez les bactéries un ARN régulateur répondant à une carence en zinc, nommé ZinS. ZinS est négativement régulé par le facteur de transcription Zur en présence de zinc. En l'absence de zinc, ZinS est synthétisé et réduit la synthèse de différentes enzymes Zn-dépendantes. De manière similaire à IsrR, le contrôle exercé par ZinS permet de diminuer les besoins en zinc.

En collaboration avec le Dr. Kehl-Fie (University of Iowa - USA), nous avons démontré que l'ARN régulateur RsaC diminue efficacement la demande cellulaire en manganèse en cas de carence. Cependant, le bénéfice de cette réponse dépend de l'environnement dans lequel S. aureus se trouve car RsaC supprime l'expression d'une superoxyde dismutase Mn-dépendante, ce qui rend S. aureus plus sensible au stress oxydant. RsaC est néanmoins nécessaire pour que S. aureus établisse une infection et son importance dépend de l'efficacité de la séquestration du manganèse par l'hôte.

Ainsi, cette caractérisation minutieuse des réseaux de régulation impliqués dans l'adaptation de S. aureus aux fluctuations des métaux a révélé que l'homéostasie du fer, du manganèse et du zinc est contrôlée par la combinaison d'un facteur de transcription sensible aux métaux et d'un ARN régulateur chez S. aureus.

Grâce au projet MetalAureus, nous avons pu identifier de nouveaux acteurs clés de l'homéostasie des métaux, et donc de la réponse adaptative de S. aureus aux stratégies défensives métal-dépendantes déployées par l'hôte. La caractérisation de ces réseaux de régulation est nécessaire pour comprendre comment ce pathogène fait face à ces stratégies immunitaires au cours de l'infection. En effet, la détermination des mécanismes d'adaptation mis en place par S. aureus pour répondre à des stress individuels dans des milieux contrôlés facilitera ensuite le passage à des environnements plus complexes pauvres en métaux, tels que les abcès.

Nos travaux ont également révélé des connexions complexes et interdépendantes entre les différents métallosystèmes. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques. Ainsi, nous envisageons d'exploiter les interactions établies en ciblant l'homéostasie d'un métal spécifique afin de rendre S. aureus plus sensible à la limitation ou à l'excès d'un autre métal.

De plus, nous avons démontré que la pompe à efflux de manganèse MntY est cruciale pour résister à divers composés antimicrobiens, échapper au système immunitaire et établir l'infection. Le fait que MntY soit une protéine essentielle et située à la surface de la membrane bactérienne fait de cette pompe une cible pertinente et attrayante pour le développement thérapeutique contre ce redoutable pathogène humain. La régulation sophistiquée de sa synthèse pour éviter la toxicité associée à sa surexpression ou à sa délétion suggère qu'elle pourrait présenter une tolérance réduite aux mutations. Nous prévoyons d'utiliser différentes stratégies pour bloquer la fonction de cette pompe et ainsi imiter les effets drastiques obtenus par la délétion du gène correspondant. Étant donné que cette protéine membranaire est conservée, cette stratégie thérapeutique pourrait être étendue à d'autres bactéries pathogènes.

Staphylococcus aureus est un pathogène majeur de l’Homme, responsable d’un large éventail d’infections nosocomiales et communautaires allant d’infections bénignes à de graves infections systémiques. La propagation de souches hypervirulentes et multirésistantes aux antibiotiques est d’autant plus alarmante. Ainsi est-il urgent d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour pallier ce problème majeur de santé publique.
Une stratégie prometteuse est de mimer et renforcer les défenses immunitaires préexistantes, notamment basées sur la modulation de la biodisponibilité des métaux. En effet, les cellules immunitaires de l’hôte peuvent tout aussi bien limiter l’accès aux métaux essentiels qu’empoisonner S. aureus par une surdose. Cependant, S. aureus a développé des mécanismes de réponse efficaces pour survivre à la carence en métaux mais aussi à leurs effets toxiques. Nos données préliminaires montrent que les ARN régulateurs (ARNrég) y jouent un rôle crucial. Découverts au début des années 80, les ARNrég sont reconnus pour être des acteurs clés dans tous les aspects de la physiologie bactérienne (métabolisme primaire, division cellulaire ou virulence). Ils sont généralement impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’un ensemble d’ARN messagers, constituant leur interactome. Notamment, nous avons découvert l’analogue fonctionnel de RyhB chez S. aureus, véritable chef d’orchestre de l’homéostasie du fer (Fe) lorsque celui-ci vient à manquer. De plus, nous avons identifié le premier ARNrég répondant à la carence en manganèse (Mn), nommé RsaC. Sa fonction principale est d’économiser le manganèse intracellulaire au travers de la répression de protéines Mn-dépendantes mais non-essentielles comme la superoxide dismutase A. En parallèle, RsaC joue un rôle décisif dans la réponse au stress oxydatif en favorisant une voie alternative Fe-dépendante de détoxification des espèces réactives de l’oxygène, produites par le système immunitaire pour éradiquer S. aureus. RsaC possède aussi un rôle plus large dans la réponse aux stresses liés à la biodisponibilité du fer et du zinc, mais aussi dans la synthèse de facteurs de virulence, renforçant le rôle central des ARNrég dans l’adaptation aux défenses immunitaires métal-dépendantes et la virulence chez S. aureus.
L’objectif principal du projet MetalAureus est de révéler le rôle fondamental des ARNrég dans l’adaptation de S. aureus à la carence en métaux mais aussi à leur toxicité, stresses typiquement rencontrés lors de l’infection. Comme S. aureus doit moduler finement la concentration intracellulaire de nombreux métaux, nous sommes convaincus que plusieurs ARNrég restent à identifier. Pour ce faire, nous caractériserons l’ensemble des ARNrég impliqués dans l’homéostasie de 6 métaux (Fe, Mn, Zn, Cu, Co et Ni) considérés comme essentiels pour la physiologie et virulence de S. aureus. Ensuite, nous découvrirons leurs fonctions par la détermination de leur interactome en utilisant une combinaison d’approches innovantes et complémentaires de séquençage d’ARN à haut débit (DBRI et MAPS). Ceci sera effectué premièrement en conditions de croissance contrôlées (ex : milieu carencé ou, à l’inverse, surdosage en métal) pour démêler ces réseaux de régulations interreliés. Ceci facilitera aussi l’interprétation des données obtenues dans des conditions plus complexes mais aussi plus physiologiques. En effet, le but ultime est d’examiner à la fois les défenses mises en place par l’hôte et les contremesures développées par S. aureus pendant le combat pour l’accès aux métaux en utilisant la méthode Dual RNA-seq.
Le projet MetalAureus représente une occasion unique de comprendre les mécanismes employés par S. aureus pour échapper aux défenses immunitaires métal-dépendantes. La caractérisation de cette réponse est notamment essentielle pour exploiter au mieux les activités antimicrobiennes des métaux et de leurs différents chélateurs, véritables alternatives aux antibiotiques classiques.