Caractérisation de la chorégraphie orchestrée par l'hétérodimère Ku sur les cassures double-brin de l'ADN – BreakDance

Les cassures double-brin (CDBs) sont parmi les lésions les plus toxiques de l’ADN. Paradoxalement, elles sont générées de façon intentionnelle lors des traitements par radiothérapie ou lors de l’édition de génomes par l’approche CRISPR-Cas9. La voie de réparation par jonction directe (c-NHEJ pour "classical Non-Homologous End Joining") est la voie principale de réparation humaine des CDBs. La génération maitrisée de CDBs nécessite une compréhension fine des bases moléculaires du c-NHEJ. L’hétérodimère Ku70/Ku80 (Ku) reconnait les CDBs et recrute de manière itérative de nombreux facteurs du c-NHEJ par des motifs conservés appelés KBMs (pour Ku Binding Motifs). Ku joue également un rôle central pour le maintien à proximité des deux extrémités de la CDB (appelée synapse) qui permet de prévenir des ligatures erronées. Les bases moléculaires de la chorégraphie spatiale et temporelle des facteurs du c-NHEJ autour de Ku sont encore mal connues

Le projet BreakDance est centré sur l’étude de 6 facteurs du c-NHEJ qui contiennent un ou plusieurs motifs de type KBM. Ces facteurs sont les facteurs de ligature, XLF et PAXX, les nucléases APLF et WRN et les deux polymérases de la famille X, Pol mu et TdT. Les partenaires 1, 2 et 4 ont récemment montré par une étude structurale et fonctionnelle que les KBMs de APLF et XLF interagissent sur deux sites éloignés de Ku80, que le KBM de XLF entraine une large ouverture de Ku80 et enfin que APLF et XLF ont un rôle coopératif pour le c-NHEJ (Nemoz, 2018, NSMB). Auparavant, les partenaires 1 et 4 avaient également collaboré sur le KBM de PAXX et montré que ce motif interagit sur la sous-unité Ku70 (Tadi, 2016, Cell Reports).

Un premier objectif est d’étendre la stratégie utilisée avec succès pour APLF et XLF à l’étude structure-fonction de l’interaction entre le complexe Ku/ADN et les KBMs de 4 autres facteurs du c-NHEJ. Nous étudierons par des approches structurales, biochimiques et cellulaires les KBM de PAXX, de WRN (qui en possède 3), et des polymérases X, Pol mu and TdT. Ceci permettra une cartographie complète de l’ensemble des sites d’interaction des KBMs sur Ku et mettra en évidence les synergies et compétitions entre les facteurs du c-NHEJ possédant des KBMs.

Un second objectif est de positionner les protéines entières contenant des motifs KBM par rapport au complexe Ku/ADN afin d’évaluer la relation entre le site d’interaction des KBMs et le positionnement des sites fonctionnels de ces protéines. Nous nous concentrerons sur la protéine PAXX et sur des domaines de WRN en complexe avec Ku/ADN pour lesquels les partenaires 1 et 3 ont obtenu des premières classes 2D par cryoEM.

Un troisième objectif concerne le maintien à proximité des extrémités d’une CDB en présence du complexe de ligature LIG4/XRCC4/XLF ou de polymérases X. Le consortium combinera ses expertises pour dévoiler les bases moléculaires de ces assemblages centraux du c-NHEJ.

Le projet BreakDance comprend des objectifs et sous-objectifs de niveaux de difficultés différents. Les tâches sont partiellement indépendantes, peuvent être menées en parallèle et s’appuient sur de nombreuses données préliminaires. Notre consortium possède les expertises nécessaires en biologie structurale, cellulaire et biochimie pour mener avec succès les défis proposés. Le projet apportera également de nouveaux outils utiles à des projets sur la maintenance des génomes : méthodes robustes de production des protéines du c-NHEJ dans différents hôtes, ou large ensemble de tests fonctionnels du c-NHEJ in vitro et en cellules. Ce projet représentera une étape majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires d’assemblage des protéines du c-NHEJ autour d’une CDB. Il ouvrira la voie à la caractérisation de nouvelles molécules permettant d’augmenter l’efficacité des traitements par radiothérapie ou l’efficacité des méthodes d'édition des génomes.