E´tude de structures prote´iques dans leur environnement cellulaire natif par re´sonance paramagne´tique e´lectronique – InVivoNanoSpin

L'objectif est de cre´er de nouveaux outils permettant des mesures intracellulaires a` l'e´chelle du nanome`tre de la structure des prote´ines par double re´sonance e´lectronique pulse´e (PELDOR). Des acides amine´s classiques ou non-naturels (UAAs) seront utilise´s pour introduire dans des prote´ines des e´tiquettes de spin Mn(II) et Gd(III) paramagne´tiques, ge´ne´tiquement codables et capables d'auto-assemblage. Jusqu'ici, l'approche la plus courante a e´te´ de greffer des radicaux nitroxyde aux cyste´ines pre´sentes naturellement sur les prote´ines ou introduites par mutage´ne`se dirige´e. Cette approche a 4 inconve´nients majeurs : 1) l'usage de cyste´ines est proble´matique pour les prote´ines ayant de´ja` des cyste´ines importantes pour la structure ou la fonction; 2) la stabilite´ et la dure´e de vie des nitroxydes sont fortement diminue´es par le milieu cellulaire re´ducteur; 3) le marquage intracellulaire est tre`s difficile a` cause de l'encombrement du milieu; 4) les proprie´te´s magne´tiques des radicaux ne permettent pas d'exploiter la sensibilite´ supe´rieure des hauts champs magne´tiques. L'utilisation d'ions me´talliques stables et de UAAs permettra de surmonter ces inconve´nients. Nous exploiterons la biologie mole´culaire classique et les nouvelles techniques d'expansion du code ge´ne´tique pour introduire de manie`re cible´e des complexes prote´iques porteurs de fonctionnalite´s qui formeront des e´tiquettes paramagne´tiques a` l'inte´rieur des cellules. Cette approche e´vitera l'isolation et la modification post-translationnelle et permettra une de´tection dans la cellule, rendant inutiles les proce´dures invasives utilise´es actuellement pour introduire des prote´ines marque´es dans les cellules. La premie`re strate´gie de´veloppera l'utilisation de courtes se´quences aminoacide. Nous avons re´cemment montre´ que deux e´tiquettes de spin me´talliques peuvent e^tre ge´ne´tiquement introduites sur une me^me prote´ine, assemble´es et la distance les se´parant mesure´e dans la cellule sans intervention supple´mentaire (isolation, purification ou transformation chimique), ceci en introduisant des se´quences Lanthanide Binding Tags (LBT), puis par incubation de la culture cellulaire en pre´sence de Gd(III). Le Mn(II) fixe´ a` des e´tiquettes His-tag peut aussi e^tre utilise´ comme marqueur de spin en conditions cellulaires, malgre´ la faible affinite´ de ces e´tiquettes pour Mn(II). L'ajout de Mn(II) et Gd(III) au milieu de culture n'affecte ni la croissance cellulaire, ni l'expression prote´ique ni la survie. Nous optimiserons cette approche en ame´liorant la fixation, la flexibilite´ et les proprie´te´s spectroscopiques des marqueurs de spin me´talliques auto-assembleurs (SAMSL). La deuxie`me strate´gie utilisera des UAAs et l'expansion du code ge´ne´tique pour introduire de nouvelles fonctions chimiques. Une premie`re approche consistera a` incorporer un UAA pour introduire en un site spe´cifique d’une prote´ine (ou sur une prote´ine spe´cifique avec une localisation particulie`re dans la cellule) une ancre a` laquelle une e´tiquette de spin peut e^tre fixe´e. Ceci n’est pas possible avec des cyste´ines. La deuxie`me approche utilisera un UAA pour cre´er un site de fixation de me´taux qui peut e^tre utilise´ comme SAMSL, un His- tag ou LBT, mais plus versatile et compact. Des UAAs capables de fixer des me´taux ont de´ja` e´te´ introduits dans des prote´ines. En exploitant ces strate´gies plus flexibles de marquage de spin par des me´taux, nous ferons des e´tudes intracellulaires de l'organisation tridimensionnelle de la ge´phyrine, une prote´ine de l'e´chafaudage synaptique, ainsi que de ses interactions avec les inhibiteurs récepteurs de la glycine (GlyR). L'objectif a` terme est de produire une boi^te a` outils robuste d'introduction par codage ge´ne´tique de marqueurs de spin me´talliques qui e´largira le champ d'application de la PELDOR in vitro et rendra les mesures intracellulaires plus courantes.