Reassortiments et virus multipartites – Reassort

Toutes les expériences ont utilisé le FBNSV comme espèce modèle principale. Son génome est composé de 8 segments ssDNA (nommés C, M, N, R, S, U1, U2, U4), chacun codant pour un seul gène. La transmission par vecteur (puceron) est mal caractérisée, mais on suppose qu'elle est du type circulant non propagatif, les particules virales se déplaçant de l'intestin aux glandes salivaires des pucerons sans se répliquer. Pour les études sur l’effet des réassortiments nous avons utilisé deux génotypes, [FBNSV-AZ;15] et [FBNSV-AZ;10/12b], et leurs hôtes de terrain respectifs, Vicia sativa [vesce) et Lens culinaris (lentille). Ces isolats ont été choisis parce qu’ils appartiennent à des clades différents du FBNSV, et donc leurs segments peuvent être différenciés génétiquement, ils ont été isolés à des localités très proches géographiquement et sur des espèces hôtes différentes. Des clones infectieux de ces deux génotypes n’étant pas disponibles avant notre étude il a fallu les créer ex silico. Les clones infectieux peuvent être infiltrés dans les fèves ou transmis par puceron aux vesces et lentilles à partir de fèves infectées. Les autres espèces du genre Nanovirus utilisées pour étudier les réassortiments interspécifiques sont le faba bean necrotic yellows virus (FBNYV), dont l'hôte par défaut est la fève, Vicia faba, et le pea necrotic yellows dwarf virus (PNYDV), plus éloigné génétiquement, le pois (Pisum sativum) étant son hôte par défaut. Ils ont une organisation génomique similaire au FBNSV. Les clones infectieux de ces deux espèces étaient déjà disponibles. Pour les études sur l’implication de la transmission non-concomitante des segments aux réassortiments nous avons utilisé le génotype [FBNSV – JKI2000] dont la plante hôte par défaut est la fève et dont nous disposions un clone infectieux avant le début de ce projet. Nous avons étudié l’effet des réassortiments d’un segment entre génotypes viraux en infectant les plantes avec des génotypes constitués d’un segment hétérologue et de sept segments du fond génomique. Pour chaque plante infectée nous avons caractérisé les effets de l’infection sur la plante au cours du temps (symptômes, hauteur), quantifié la charge de chaque segment et donc de leur ensemble par qPCR, et estimé la capacité de transmission de l’infection par puceron. Nous avons mis en compétition certains segments de deux génotypes dans un contexte génomique donné (p.ex. infection par les segments C de deux isolats et les sept autres segments d’un des deux isolats) pour observer le résultat de la compétition. Nous avons fait évoluer pendant dix passages successifs par puceron certains génotypes réassortants et des génotypes parentaux en parallèle, pour voir si les caractéristiques des réassortants évoluent au cours du temps.

Nous savions que la formule génomique (distribution des fréquences des différents segments au sein d’un hôte) change avec l’espèce hôte ; nous avons pu montrer ici que les formules génomiques de trois génotypes de FBNSV diffèrent pour une espèce hôte donnée. Ainsi la formule génomique varie à la fois selon l’espèce hôte et selon le génotype viral. L’analyse systématique des effets des réassortiments intraspécifiques d’un segment du FBNSV a montré que globalement le phénotype des infections (symptômes et hauteur des plantes hôtes, charge virale, taux de transmission) est peu sensible aux réassortiments. À l’inverse, la formule génomique est très labile, les réassortants ayant des formules génomiques différentes de celles de leurs parents dans presque tous les cas. Pour les expériences qui suivent nous avons dû nous concentrer sur deux segments pour des raisons logistiques. Nous avons choisi C et U1 parce que nous avons observés des grands écarts de formule génomique pour les réassortants de ces segments. Les compétitions entre segments codant pour la même protéine dans un contexte génomique donné ont montré que les segments de [FBNSV-AZ;10/12b] s’accumulent plus que ceux de [FBNSV-AZ15] quel que soit le contexte génomique. L’évolution expérimentale pendant 10 passages par pucerons de génotypes réassortants conduit à l’extinction au cours des passages de presque tous les génotypes réassortants, alors que les génotypes parentaux se maintiennent. Les réassortiments interspécifiques entre FBNSV, FBNYV et PNYDV ont été étudiés pour les segments R, C et U2, à cause des niveaux de divergence génomique entre espèces faible, moyen et élevé. Par ailleurs FBNSV et FBNYV sont proches alors que le PNYDV leur est plus éloigné génétiquement. Les résultats dépendent de la distance génétique entre parents sur l’ensemble du génome, de la distance génétique sur le segment réassorti, et de la plante hôte. Sur la fève, hôte d’origine du FBNSV et du FBNYV aucun réassortant impliquant un segment, quel qu’il soit parmi les trois testés, du PNYDV dans un fond génétique FBNSV ou FBNYV ne fonctionne : pour U2 et C nous obtenons des infections mais constituées uniquement des 7 segments du parent majoritaire. Comme R est indispensable à l’infection, les réassortants pour R ne sont pas viables à cette échelle de différenciation génomique. Les réassortants entre FBNSV et FBNYV pour R se complémentent bien, mais pour U2 et C la complémentation est unidirectionnelle : les segments de FBNSV complémentent bien le fond génomique FBNYV mais dans le sens inverse les segments réassortis de FBNYV ne se retrouvent pas dans les plantes infectées, nous ne retrouvons que les 7 segments du fond génomique FBNSV. Enfin, sur le pois, hôte d’origine du PNYDV, les réassortants impliquant un segment de cette espèce fonctionnent dans tous les cas sauf U2 dans un fond FBNYV. La transmission des différents segments peut se faire de manière indépendante et décalée dans le temps.

La découverte de la possibilité d’une transmission non-concomitante des segments génomiques ouvre plusieurs perspectives. D’abord cette découverte a été faite en étudiant la transmission de segments non-essentiels. Il serait important de confirmer que cette transmission non-concomitante peut aussi se faire lorsque des segments essentiels sont impliqués. En particulier il faudra caractériser la fenêtre temporelle pendant laquelle le sauvetage des segments inoculés lors d’une première transmission peut se faire par une seconde inoculation amenant les segments manquants ; en d’autres termes connaître l’espérance de vie des segments génomiques latents. Outre une meilleure estimation du coût putatif du maintien de l’intégrité génomique des virus multipartites, cette connaissance permettrait de mieux caractériser, et donc comprendre, la circulation des segments génomiques dans un paysage. Les résultats sur les effets phénotypiques des réassortiments intra- et interspécifiques montrent une grande robustesse aux premiers, médiée probablement par la labilité de la formule génomique, et une intolérance aux seconds mais dépendante de la plante hôte. Ainsi les échanges génomiques et la complémentation semblent pouvoir se faire facilement entre différents génotypes d’une même espèce, permettant aux virus d’explorer l’espace génotypique mais aussi de complémenter facilement des inoculations incomplètes, contournant le problème du maintien de l‘intégrité génomique. Au niveau interspécifique des barrières bien plus rigides sont observées, mais des ponts d’échange, dépendant de la plante hôte, existent. Il ne faut pas perdre de vue que ces résultats et inférences sont basés sur les échanges d’un seul segment ; potentiellement les barrières pourraient être plus importantes si plusieurs segments sont impliqués, ce qui reste à confirmer. Ainsi, et en combinaison avec la transmission non-concomitante des segments, il devient important de s’intéresser maintenant à la circulation des segments génomiques de plusieurs génotypes de plusieurs espèces virales dans un paysage constitué de plusieurs espèces de plantes hôtes, plus ou moins favorables aux différents génotypes et permissives à leurs réassortiments, connectées par différentes espèces de vecteurs. Une telle étude permettrait de connaître in natura les contraintes aux quelles ces virus doivent faire face, mais aussi les opportunités qui s’offrent à eux pour survivre, se transmettre, inventer de la nouveauté génétique et s’adapter à leur environnement. Cette connaissance devrait nous permettre de mieux caractériser le risque que représentent potentiellement les virus multipartites pour leurs plantes hôtes, qui dans le cas des Nanovirus sont les Légumineuses, importantes pour l’agriculture (https://agriculture.gouv.fr/les-legumineuses-une-famille-de-vegetaux-redecouvrir).

Les échanges génétiques sont un des mécanismes principaux générant la variabilité intra-populationnelle sur la quelle agit la sélection naturelle. Même s’ils peuvent générer quelques génotypes extrêmement bénéfiques, ils produisent également beaucoup de génotypes délétères ; le bilan exhaustif qui résulterait de l’examen systématique des effets d’échanges génétiques entre deux génotypes est difficile à prévoir et n’est actuellement connu sur aucun organisme. Ce projet ambitionne de combler cette lacune en utilisant comme modèle d’étude les virus multipartites dont le génome est composé de plusieurs segments encapsidés séparément, chaque particule virale ne contenant qu’un seul segment, chaque segment ne codant que pour un seul gène. Les virus multipartites peuvent échanger des segments entiers, un mécanisme d’échange génétique appelé ‘réassortiment’. En utilisant le nanovirus octopartite ‘faba bean necrotic stunt virus’ (FBNSV), un parasite des légumineuses, nous mesurerons plusieurs composantes de la fitness virale de réassortants intra- ou inter-spécifiques pour un seul segment/gène. Ceci nous permettra d’estimer si les réassortiments sont en moyenne bénéfiques ou délétères and si certains gènes/fonctions virales sont plus susceptibles de produire des réassortants bénéfiques. Des expériences de compétition entre réassortants et génotypes parentaux montreront si des mécanismes favorisant l’intégrité génomique des espèces/génotypes viraux sont en action. Par ailleurs, des expériences d’évolution expérimentale établiront si les potentiels effets délétères des réassortiments peuvent être diminués par une coévolution des segments réassortants avec le reste du génome. Enfin, des expériences de transmission chercheront à montrer si les réassortiments peuvent faciliter la transmission des virus multipartites en permettant la transmission indépendante à partir d’individus hôtes différents des différents segments génomiques vers un même individu hôte. Ce projet peut ainsi proposer (i) la première caractérisation systématique de la fitness et des effets biologiques des réassortiments ; (ii) un mécanisme potentiel permettant de diminuer le coût de la transmission inter-hôtes lié au multipartitisme.