Architecture dynamique du noyau : une approche de l'imagerie des chromosomes basée sur la physique des polymères – DNA-PolyChrom

Dans le cadre du projet DNA-PolyChrom, deux séries d'expériences d'imagerie seront réalisées. Dans une première série, nous suivrons ~50 foyers non fonctionnels individuels qui sont insérés de manière aléatoire dans le génome de la Drosophile. Une deuxième série d'expériences consiste en dix foyers fonctionnels qui sondent l'activité transcriptionnelle de dix gènes bien caractérisés. Certains des loci fonctionnels seront appariés avec un ou plusieurs loci non fonctionnels proches, à des distances allant de 25 kb à 3 Mb, y compris un gène exprimé dans les cellules larvaires. Cet ensemble sera utilisé pour suivre directement les interactions entre exhausteurs et promoteurs et la façon dont les paramètres physiques décrivant ces interactions évoluent avec la distance. En outre, nous combinerons ces deux ensembles de loci marqués pour explorer la dynamique des distances entre paires dans différentes régions génomiques et pour différents états d'activité génétique.
Ces mesures permettront de tester nos hypothèses concernant la relation entre le repliement de la chromatine, les distributions des positions des loci, les distributions des distances inter-loci, et la dynamique de la chromatine et de la transcription : Tout d'abord, la dépendance des statistiques (distribution des positions) et de la dynamique (MSD) des loci uniques par rapport à l'état de repliement local de la chromatine sera établie, par comparaison avec la modélisation théorique et numérique. Une fois ces caractéristiques des loci uniques établies, nous serons en mesure de prédire leurs conséquences sur le comportement des inter-distances par paires. Ce dernier sera mesuré dans des expériences et simulé numériquement, ce qui nous permettra de terminer avec un modèle cohérent de l'interaction entre l'état de repliement et la dynamique inter-loci.

Nous avons éalisé de vastes simulations de Monte Carlo de domaines polymères, ce qui nous a permis d'extraire des statistiques sur le rayon de giration et la distance de bout en bout, et a permis d'affiner l'inférence bayésienne des paramètres du modèle.

En parallèle, nous avons découvert de nouvelles relations d'échelle intéressantes qui conduiront à une formulation complètement nouvelle de l'énergie libre du polymère.

Une dérivation théorique de la distribution des distances de bout en bout pour des domaines polymères de différents types a également été finalisée, et sera comparée aux simulations et aux expériences.
Par ailleurs, nous avons développé une nouvelle approche basée sur l'analyse spectrale du polymère qui permet de déduire de manière directe et très efficace sa conformation 3D à partir d'un nombre très limité de ses monomères. En appliquant cette approche, nous serons en mesure de nous passer de l'imagerie par oligopeinture des conformations des domaines et de les déduire directement de la dynamique des loci.

Sur le plan expérimental, nous avons développé une technologie d'imagerie quantitative qui nous permet de mesurer les distances physiques dans un petit locus génétique pour montrer que la paire enhancer-promoter active sur le plan transcriptionnel n'est pas en contact physique, remettant en cause des règles bien établies de la régulation transcriptionnelle eucaryote. Le domaine de la transcription est actuellement en pleine mutation, car il existe de plus en plus de preuves que la structure tridimensionnelle de la chromatine et sa disposition ordonnée dans le noyau cellulaire semblent avoir un effet sur le statut transcriptionnel d'un gène. Nous abordons ces questions en utilisant l'embryon précoce de drosophile comme laboratoire pour mesurer les distances physiques entre les éléments cis-régulateurs d'un locus génétique de 18 kb dans différentes conditions topologiques et fonctionnelles.

La nouvelle formulation de l'énergie libre des polymères peut avoir un grand intérêt d'un point de vue théorique. En effet, nous avons déterminé empiriquement de nouvelles variables d'échelle, permettant une représentation universelle de tous les polymères partageant les mêmes propriétés de repliement, par exemple la même distribution de taille. Ce nouveau formalisme diminue considérablement la complexité du modèle, permettant (1) une inférence beaucoup plus facile de ses paramètres à partir des données de simulation, (2) une mise en correspondance plus pratique des systèmes réels avec une représentation polymère.

La nouvelle approche permettant d'évaluer la configuration du polymère (coil, globule) en recueillant les positions relatives de seulement trois loci discernables et régulièrement espacés pourrait donner lieu à une nouvelle méthode expérimentale très économe pour évaluer l'état épigénétique, facilement réalisable avec les techniques modernes d'imagerie fluorescente in vivo. Cela a un impact particulier sur notre projet car cela évite la mise en place d'expériences complexes de super résolution.

Assessing the polymer coil-globule state from the very first spectral modes, Timothy Földes, Antony Lesage, Maria Barbi
doi: doi.org/10.1101/2021.07.17.452647

Transcription-dependent spatial organization of a gene locus. Barinov L. et al arXiv:2012.15819 [q-bio.MN]. 2020 December.

Using RNA Tags for Multicolor Live Imaging of Chromatin Loci and Transcription in Drosophila Embryos. Chen H, Gregor T. Methods Mol Biol. 2020;2166:373-384. doi: 10.1007/978-1-0716-0712-1_22. PubMed PMID: 32710421.

Action at a distance in transcriptional regulation. Bialek W, Gregor T, Tkacik G. arXiv:1912.08579 [q-bio.SC]. 2019 December.

La chromatine, assemblage ADN-protéine qui remplit le noyau, est organisée en compartiments multi-échelles. En quantifiant le nombre d'interactions entre loci génomiques, la technologie HiC a révélé qu'un niveau d'organisation important est, à l'échelle 10 kb - 1 Mb, le Topologically Associating Domain (TAD), dont le rôle semble être d’isoler, en 3D, différents segments du génome, de sorte que leurs activités individuelles n’interfèrent pas. Les techniques de fluorescent in situ hybridization et microscopie super-résolue ont en effet révélé des compartiments plus ou moins séparés et décrit leur organisation en mesurant leur variance spatiale (ou rayon de gyration). Dans la Drosophile, les lois d'échelle décrivant comment les rayons de giration augmentent avec la longueur génomique des domaines montrent une nette différence pour les trois différents états d'activité : actif (en transcription), inactif ou réprimé.
Les domaines fonctionnels de la chromatine peuvent également être définis en fonction de la présence de marqueurs biochimiques appelés marques épigénétiques. La coloration épigénétique est spécifique des différents états d'activité des gènes : chez la drosophile, les TAD, les domaines d'activité et les domaines épigénétiques coïncident, avec trois couleurs épigénétiques ("rouge", "noir" et "bleu") correspondant respectivement aux trois états d'activité mentionnés ci-dessus. L'épigénétique est responsable du contrôle temporel et spatial de l'activité des gènes pendant la différenciation cellulaire, et nous suggérons que l'arrangement 3D pourrait être le moyen mécanistique par lequel l'épigénétique contrôle l'activité des gènes.
Les aspects dynamiques peuvent également être étudiés. Le tracking in vivo permet de quantifier la diffusion de loci chromosomiques uniques et révèle de multiples interactions dynamiques. Notre Partner 3 a montré expérimentalement qu'une proximité physique prolongée entre enhancer et promoter est nécessaire à la transcription, avec un contact plus rapproché. Cependant, aucun résultat clair n'a été obtenu permettant de relier ni la diffusion de loci uniques, ni les distances ou les fréquences de contact inter-loci avec l'état d’organisation sous-jacent de la chromatine. Notre projet vise à combler cette lacune. Nous fournirons une théorie qui décrit les domaines en termes de polymères dont l’état physique, proche de la criticité, peut expliquer l'origine des transitions de phase dans l'environnement nucléaire.
Nous aborderons la question de savoir si la proximité entre enhancer et promoter observée est la signature d'une dynamique optimisée où la rapidité, la fréquence des rencontres ou la sélectivité de toute rencontre inter-loci est maximisée. Comment ces caractéristiques dynamiques dépendent-elles de l'organisation 3D des domaines actifs, inactifs, réprimés ? Pour y répondre, nous identifierons un ensemble de domaines épigénétiques et étudierons in vivo la distribution et les fluctuations des distances entre loci chez la Drosophile par imagerie multi-color. L'état de repliement du domaine sera caractérisé indépendamment, par super-résolution.
Lier l'épigénétique, le repliement des domaines et la dynamique nécessitera l'élaboration de méthodes d’analyse des données performantes et d'un modèle théorique cohérent. Les partenaires 1 et 2 ont déjà jeté les bases d'un tel modèle en développant (i) la description de la diffusion de loci uniques dans le cadre de la dynamique des polymères, introduisant le concept de Rouse with transient internal contacts, et (ii) une nouvelle méthodologie pour maximiser l’information tirée des données de super-résolution, montrant que les ces dernières sont compatibles avec le comportement d'un self-attracting polymer proche de la transition coil-globule. Cela met en évidence le rôle crucial de la criticité pour améliorer la susceptibilité du système, avec potentiellement conséquences intéressantes sur la dynamique qui seront explorées dans le cadre de ce projet.