Etude des fonctions pléiotropiques de l'acide phosphatidique dans la sécrétion régulée à l'aide d'une nouvelle boite à outils moléculaires – PA-Box

Les techniques qui permettent la manipulation des niveaux cellulaires de lipides spécifiques sont d'une grande importance dans l'exploration de leur fonction cellulaire, mais les outils actuellement disponibles pour l'analyse des PA ne sont pas optimaux en raison du manque de spécificité subcellulaire et d'un timing d'activité inadéquat. En effet, de bons agents pharmacologiques pour moduler l'activité des enzymes produisant et métabolisant le PA font actuellement défaut, à l'exception des inhibiteurs de la PLD. Deuxièmement, l'analyse moléculaire des lipides est actuellement largement limitée aux techniques de knock-out (KO), knock-down (KD) ou knock-in (KI) des gènes, ainsi qu'à la surexpression des gènes impliqués dans leur métabolisme, ce qui est associé à plusieurs mises en garde, telles que les changements adaptatifs compensatoires, puisque ces manipulations se produisent entre quelques heures et quelques jours et souvent dans l'organisme tout entier.

Pour contourner ces insuffisances, nous proposons maintenant de concevoir des outils moléculaires qui permettront l'expression d'enzymes métabolisant les PA dans des compartiments subcellulaires spécifiques en utilisant des vecteurs d'expression codant pour des peptides de ciblage spécifiques, et ce de manière contrôlée et opportune. Dans un premier temps, nous nous concentrerons sur le ciblage du RE, des mitochondries, du Golgi, des granules sécrétoires, des endosomes et de la membrane plasmique, des compartiments intracellulaires contenant des niveaux détectables de PA. Nous proposons donc de créer des outils qui permettront la synthèse locale de PA par les PLD, les DAGK, les LPAAT ou sa conversion en d'autres lipides par les PA-phosphatases, les CDP-DAG synthétases, les PLA.

Une autre approche pour manipuler les niveaux de PA est l'ajout direct d'analogues de PA perméables à la membrane. En effet, nos données préliminaires indiquent que l'apport de PA commerciaux par le biais du milieu extracellulaire permet de remédier aux défauts de sécrétion dus à l'inhibition de la PLD. En s'appuyant sur le savoir-faire du Partenaire 2 en fluorescence, chimie des organophosphorés, chimie des bioconjugués et chimie click, des analogues de PA portant un groupe de tête phosphate cagé qui peut être décagé après illumination UV seront synthétisés in vitro. Profitant d'une fonction de greffage polyvalente introduite sur les analogues de PA, nous générerons également des analogues de PA marqués avec un fluorophore ou inductibles pour une réticulation sélective induite par la lumière afin d'étudier à temps le lien physique entre le PA et les interacteurs dans les membranes subcellulaires par le biais de la formation de liaisons covalentes.

Après avoir établi des conditions expérimentales dans lesquelles l'addition de PA exogène peut atteindre le feuillet interne de la membrane plasmique, nous avons pu montrer que des espèces individuelles de PA et parmi elles des formes insaturées jouent des rôles spécifiques dans des étapes distinctes de la sécrétion des hormones de stress. Par exemple, le PA produit par PLD1 contribue à la biogenèse des vésicules sécrétoires au niveau du TGN et à leur transport vers la périphérie de la cellule. Plus spécifiquement, les PA mono-insaturés régulent l'arrimage des vésicules, tandis que les formes poly-insaturées des PA contrôlent la dynamique du pore de fusion. La synthèse de PA à la membrane plasmique nécessite l'activation de PLD1 par une combinaison de kinases et de GTPases telles que Arf6. La dissociation des segments V1 et V0 de la V-ATPase sur les granules sécrétoires est nécessaire pour l'interaction de la sous-unité V0a avec ARNO, un activateur d'Arf6.

Nous avons généré des manipulateurs inductibles du métabolisme des PA avec trois enzymes impliquées dans la synthèse des PA ( PLD, DGK et le domaine B de RIBEYE), et 2 pour l'hydrolyse des PA (LIPIN et PLA). Nous avons obtenu des versions induites par la rapamycine et la lumière pour chacune de ces enzymes afin de permettre leur adressage à des compartiments subcellulaires spécifiques. En raison du recrutement rapide des enzymes dans des sous-compartiments membranaires spécifiques, les outils induits par la lumière appelés opto-métabo-PA ont été utilisés pour sonder la contribution des PA présents dans les membranes du TGN, des granules sécrétoires, des mitochondries et de la membrane plasmique aux différentes étapes de l'exocytose (manuscrit en préparation).

Nous avons également développé une nouvelle voie de synthèse de PA portant une fonction discrète sur le squelette glycérol permettant le greffage de sondes fluorescentes in cellulo ou in vivo par chimie click afin de laisser la structure du PA modifié la plus proche possible du PA original. Ainsi, nos PA possèdent bien un monoester de phosphate en position sn-3 et deux chaînes d’acide gras différentes en position sn-1 et sn-2. Les PA synthétiques mono- et polyinsaturés obtenus avec une grande pureté ont été parfaitement caractérisés. Ceux-ci ont reproduit l'activité cellulaire de leurs homologues naturels lors de la neurosécrétion. L’étude de la dynamique de ces molécules synthétiques révèle qu'elles s'accumulent dans des sous-compartiments spécifiques en fonction de la composition de leur chaîne d'acyle gras. De plus, en utilisant une stratégie de pêche dans des cellules vivantes, nous avons pu identifier plusieurs centaines de partenaires du PA dont certains étaient connus, mais d'autres nouveaux (manuscrit en préparation). Il est intéressant de noter que la plupart des partenaires sont spécifiques de l'espèce de PA et dépendent de l'état de la cellule (voir illustration). Ces résultats ouvrent une nouvelle voie pour mieux comprendre les

Nous pensons que cette étude apportera des avancées conceptuelles majeures dans la compréhension de divers événements liés au trafic membranaire, puisque le PA a été suggéré comme étant un contributeur majeur dans des fonctions cellulaires clés pertinentes au-delà du domaine de la neurosécrétion, avec une implication dans la division et la migration cellulaires, la formation de synapses immunologiques ou la phagocytose de pathogènes et même l'interaction hôte-pathogène. Enfin, les nouveaux PA synthétiques développés dans cette proposition et la chimie permettant de les obtenir ont été brevetés (WO2023180457). Des discussions sont en cours avec des entreprises privées et la possibilité de créer une start-up axée sur le développement de capteurs phospholipidiques médicalement pertinents pour le diagnostic clinique est à l'étude.

Alors que s’accumulent des données épidémiologiques révélant un rôle fondamental des lipides de l’alimentation dans l’homéostasie cellulaire et le développement de nombreuses pathologies humaines, peu d’informations sur leurs fonctions spécifiques sont disponibles à ce jour. Ces lacunes proviennent essentiellement d’un manque d’outils moléculaires adaptés à l’étude des lipides par les approches puissantes de la biologie moderne. Ainsi, nous proposons de générer une boîte à outils permettant des études cellulaires dynamiques et biophysiques des différentes formes de l’acide phosphatidique; une famille de lipides jouant un rôle clé dans la biosynthèse des autres lipides, mais aussi dans la signalisation et dans des processus du trafic intracellulaire, tels que la genèse et la fusion des vésicules neurosécrétrices, pour lesquels les fonctions du PA commencent à être solidement établies mais largement incomprises.