Approches intégrées pour l'analyse moléculaire, protéomique et fonctionnelle du métabolisme redox du Reticulum Endoplasmique – ERRed2

Lors d’une dysfonction du réticulum endoplasmique (RE), une interaction complexe intervient entre les voies d’oxydation et de réduction des cystéines du RE et implique une production simultanée d’H2O2. Cette interconnexion avec les voies de signalisation de l’UPR (Unfolded Protein Response) influe le destin cellulaire en conditionnant une réponse adaptative ou léthale. Malgré sa pertinence en pathologie humaine, cette interaction redox reste à élucider. Pour comprendre sa nature et sa fonction, nous proposons d’élucider deux des énigmes majeures du métabolisme redox du RE : (i) les voies cytosoliques de réduction des thiols par la thioredoxine et le glutathion (GSH), contribuent-elles au repliement oxydatif des protéines, comment et avec quelles conséquences ? (ii) Quelles sont l’origine et la fonction de l’H2O2 produit lors du stress RE? Notre stratégie sera d’établir les outils permettant de manipuler ces composants, avec les modèles levure et mammifères partageant les mêmes mécanismes de repliement oxydatif des protéines, le premier en raison de sa simplicité et du pouvoir expérimental qu’il offre, et le deuxième pour sa pertinence en pathologie humaine. Le contrôle de ces voies permettra au mieux d’élucider leur rôle. Cette stratégie est organisée en cinq « work packages » (WPs). (WP1) Nous avons établi, en cellules humaines, un essai de transport du GSH dans le RE permettant de montrer que, comme chez la levure, le transport du GSH au RE suit le gradient de concentration imposé par sa synthèse cytosolique et son oxydation dans le RE. Nous utiliserons cet essai pour identifier le système de transport du GSH dans deux cribles haut-débit, l’un chimique et l’autre génétique utilisant une banque pan-génomique de siRNA. (WP2) La thioredoxine cytosolique sert de pouvoir réducteur du RE d’où elle est absente, ce qui suggère l’existence d’un relai redox la reliant à des réductases du RE. Nous rechercherons ce relai redox en identifiant le répertoire des substrats de la thioredoxine de levure selon un crible génétique haut-débit reposant sur un essai de complémentation et réalisé par le collaborateur israélien, et par copurification des substrats redox de la thioredoxine. L’homologue humain sera recherché et caractérisé. (WP3). Les origines de l’H2O2 produit au cours du stress RE sont controversées car il n’existe pas de détecteur d’H2O2 pour le RE. Nous établirons deux méthodes novatrices pour palier à ce manque. La première utilise la peroxydase de raifort APEX2, qui convertit le biotin-phenol en un radical en réponse à l’H2O2, ce qui entraine la biotinylation des protéines de proximité. La deuxième repose sur la visualisation globale de la S-sulfenylation des protéines du RE, après marquage in situ par le composé Dyn-2. Nous avons obtenu la preuve de concept que la biotinylation et la S-sulfenylation des protéines, par leur quantité, renseignent toutes deux sur les niveaux d’H2O2 dans le RE. (WP4) L’état redox des résidus cystéines est un marqueur de l’activité des voies de réduction des thiols. Notre procédure OcSILAC est une nouvelle stratégie de protéomique permettant simultanément mesurer l’oxydation des thiols et le niveau d’expression de protéines, pour établir le redoxome du RE. Celui-ci sera complété par l’analyse globale de la modification des protéines du RE par S-glutathionylation (chimie bio-orthogonale du GSH) , et par S-sulfenylation. (WP5) Les outils et savoirs développés dans les autres WPs seront appliqués à des modèles cellulaires modulables de stress du RE établis par le collaborateur italien, pour décrire la nature et la cinétique des évènements redox prenant place lors d’un stress du RE adaptatif ou terminal, et pour établir les fonctions de la thioredoxin et du GSH dans le RE et de celui de l’H2O2 produit. Ce projet devrait produire un modèle unique du métabolisme redox du RE et des outils novateurs, tout deux essentiels pour élucider son rôle et son importance en stress RE et en physiopathologie.