CE44 - Biochimie du Vivant

Criblage d’inhibiteurs de pompes d’efflux et pharmacomodulation pour améliorer l'efficacité des antibiotiques – SpiceUp

Criblage d’inhibiteurs de pompes d’efflux et pharmacomodulation pour améliorer l'efficacité des antibiotiques

Le projet SpiceUp vise à développer des approches innovantes pour l'identification, la caractérisation et l'inhibition des pompes à efflux. D'un point de vue plus fondamental, nous cherchons également à comprendre le mécanisme moléculaire de l'inhibition des pompes à efflux. Nous nous concentrerons sur le criblage d'inhibiteurs contre la pompe à efflux MexAB-OprM de Pseudomonas aeruginosa et contre AcrAB- TolC d'Escherichia coli.

Caractérisation d’inhibiteurs actifs sur les pompes à efflux MexAB-OprM de Pseudomonas aeruginosa et AcrAB-TolC de Escherichia coli.

Le développement d’un nombre préoccupant de souches bactériennes multi-résistantes combiné à l'absence de découverte récente de nouvelles molécules antimicrobiennes pourrait conduire, si rien ne change, à 10 millions de morts annuels d'infections par des souches multirésistantes d'ici 2050. Le développement de nouvelles stratégies antimicrobiennes s’impose. Parmi les différents mécanismes de défense développés par les bactéries à Gram négatif, l'efflux actif joue un rôle majeur. Ce processus est réalisé par des pompes d’efflux formant un complexe macromoléculaire à travers les deux membranes de la bactérie et permettant l’export d’antibiotiques avant qu’ils n’atteignent leurs cibles. Notre objectif est de développer des molécules inhibant spécifiquement les pompes d’efflux, afin de raviver la sensibilité des bactéries vis-à-vis de l’arsenal antibiotique existant. L’originalité de notre projet est de suivre spécifiquement l'activité de pompes d'efflux reconstituées in vitro dans des vésicules lipidiques artificielles. Ce système sera miniaturisé et automatisé pour permettre le criblage d’inhibiteurs à partir de banques de molécules couvrant différents espaces chimiques. Une fois sélectionnés, les inhibiteurs potentiels seront modifiés chimiquement de manière à améliorer encore leur efficacité. Ainsi, nous espérons, à la faveur de cycles itératifs de criblages/pharmacomodulations, pouvoir sélectionner un inhibiteur véritablement spécifique de pompe d’efflux. Nous concentrons nos études sur la caractérisation d’inhibiteurs actifs sur les pompes à efflux MexAB-OprM de Pseudomonas aeruginosa et AcrAB-TolC de Escherichia coli.

Notre projet porte sur les pompes d'efflux tripartites de la famille RND (membre de la famille Résistance, Nodulation, Division cellulaire). Le transporteur est une pompe alimentée par des protons et dépendante de l'énergie, située dans la membrane interne, qui fonctionne conjointement avec une protéine périplasmique de fusion membranaire (MFP) et un canal de la membrane externe (OMF). Le transporteur de la membrane interne cytoplasmique est une cible clé pour le développement d'inhibiteurs de pompe d'efflux (EPI). Ces inhibiteurs agissent comme des composés auxiliaires car ils ne possèdent pas d'activité antibiotique par eux-mêmes, mais agissent en bloquant la pompe d'efflux et améliorent ou restaurent ainsi l'activité des antibiotiques existants. La recherche sur les inhibiteurs offre une nouvelle voie pour développer de nouveaux médicaments ou pour restaurer l'efficacité de composés connus. Les combinaisons thérapeutiques recommandées (un antibiotique de la classe des bêta-lactamines associé à un aminoglycoside ou à une fluoroquinolone) conduisent souvent à des échecs thérapeutiques en raison de la poly-spécificité des pompes d'efflux qui peuvent extraire efficacement tous ces médicaments des bactéries et, lorsqu'elles sont surproduites, rendre les bactéries multirésistantes. Il faut alors prescrire des composés de dernier recours comme la polymyxine. La voie de la mise en œuvre des inhibiteurs microbiens peut être entravée par le fait que la manipulation des systèmes d'efflux peut entraîner une toxicité inattendue en raison de la multitude de rôles physiologiques que les transporteurs jouent dans les cellules humaines. Ainsi, les efforts visant à inhiber spécifiquement les pompes d'efflux fonctionnant uniquement chez les procaryotes, telles que les pompes RND, pourraient offrir de meilleures chances de succès thérapeutique. Le développement d'un inhibiteurs universel ou spécifique à une espèce, applicable en clinique, pour les pathogènes à Gram négatif reste un défi.

La nouveauté de notre projet est d'appliquer une méthodologie originale et unique qui permet de suivre spécifiquement l'activité de pompes d'efflux reconstituées in vitro à partir de bactéries Gram négatives. Cette méthodologie est déjà opérationnelle et disponible pour le criblage d'inhibiteurs. Nous nous concentrerons sur la caractérisation des inhibiteur actifs sur les pompes à efflux MexAB-OprM de Pseudomonas aeruginosa et AcrAB-TolC de Escherichia coli.

• Le protocole d’expression, purification, reconstitution est réalisé en routine et avec de bons rendements. Des tests de perméabilisation de liposomes à moyen débit ont été développés.
• Trois banques de molécules, dont une issue d’une première campagne de pharmacomodulation, ont été testées sur bactérie. Des molécules candidates ont été identifiées.
• Un pool de 37 molécules les plus intéressantes ont été soumises au test in vitro de perméabilisation. Une minorité de molécule ayant un effet intrinsèque sur l’intégrité de la membrane est exclue.

Le consortium fonctionne très bien. La communication entre les différentes équipes permet de communiquer les avancées respectives et de résoudre rapidement les problèmes rencontrés. Nous sommes parfaitement dans les temps par rapport à notre planning.

sans objet

La résistance aux antibiotiques chez les agents pathogènes à Gram négatif est un problème de santé publique majeur. De nouvelles pistes antimicrobiennes sont indispensable pour contrer ce phénomène. Parmi les différents mécanismes de résistance mis au point par les bactéries, les pompes à efflux sont en première ligne. Elles sont constitués d’édifices membranaires qui expulsent les xénobiotiques à travers les deux membranes de la paroi bactérienne. Les pompes d’efflux sont des cibles thérapeutiques prometteuses car leur blocage pourrait restaurer l'utilité de l’arsenal antimicrobien.
Notre projet consiste à identifier des inhibiteurs qui joueront le rôle d’adjuvant: sans activité antibiotique intrinsèque mais fonctionnant en bloquant les pompes d’efflux, rétablissant ainsi l'activité des antibiotiques. Habituellement, l'activité de tels inhibiteurs est déduite de mesures dans lesquelles la sensibilité des bactéries à différents antibiotiques est mesurée chez la bactérie en l'absence ou en présence des molécules d’intêret. La nouveauté de notre projet est d’appliquer une méthodologie originale et unique qui permet d’étudier spécifiquement l’activité des pompes à efflux reconstituées in vitro. Ce test repose sur la reconstitution des pompes d'efflux dans des protéoliposomes mimant l'architecture à deux membranes de l'enveloppe de bactéries à Gram négatif, et sur la mesure du transport des substrats à travers la pompe à l'aide de sondes fluorescentes.
Les banques de molécules seront testées contre des souches à Gram négatif (P. aeruginosa, E. coli, E. aerogenes) dans le cadre d'essais fonctionnels et phénotypiques comparant des souches dépourvues ou surexprimant les systèmes d'efflux. Ainsi, la combinaison de nos expertises nous permettra d’explorer de nouveaux espaces chimiques et servira de base à des campagnes de pharmacomodulation chimiques.
A terme, la méthodologie sera adaptée, miniaturisée et automatisée sur lecteur de microplaques à 96 puits, permettant ainsi de tester automatiquement des librairies chimiques à grande échelle.
Notre objectif sera de caractériser des inhibiteurs actifs sur les pompes à efflux MexAB-OprM de Pseudomonas aeruginosa et AcrAB-TolC de Escherichia coli.

Coordination du projet

Martin PICARD (Laboratoire de biologie physico-chimique des protéines membranaires)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

LBPCPM Laboratoire de biologie physico-chimique des protéines membranaires
MCT Membranes et Cibles Thérapeutiques

Aide de l'ANR 357 892 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2019 - 48 Mois

Liens utiles

Explorez notre base de projets financés

 

 

L’ANR met à disposition ses jeux de données sur les projets, cliquez ici pour en savoir plus.

Inscrivez-vous à notre newsletter
pour recevoir nos actualités
S'inscrire à notre newsletter