hydroxylation indépendante d'O2 et synthèse anaérobie d'ubiquinone – O2-taboo

La tâche 1 du projet vise à comprendre le contrôle et la physiologie de la voie UQ indépendante d’O2 en anaérobiose (absence d’O2) et en microaérobiose (faibles concentrations d’O2). Pour cela, nous disséquerons l’importance et la régulation de la voie en construisant des mutants d’Escherichia coli pour les diverses voies de production de quinones et nous étudierons leurs phénotypes dans des conditions d’atmosphère contrôlée en O2, ainsi que dans un contexte physiologique, l’intestin de souris. La tâche 2 vise à comprendre le fonctionnement des protéines UbiU et UbiV qui constituent une nouvelle classe d’enzymes catalysant des réactions d’hydroxylation indépendamment d’O2. Pour cela, nous mettrons en œuvre une palette de techniques couvrant la chimie organique (synthèse de substrats et de produits marqués), la biochimie (purification des protéines et études spectroscopiques et enzymatiques), la biologie structurale (résolution des structures tridimensionnelles des protéines par cristallographie des rayons X). La tâche 3 aura pour but d’établir le rôle de la protéine UbiT et de vérifier si les protéines de la voie de production de UQ O2-indépendante s’organisent sous forme d’un complexe multiprotéique tel que nous avons pu le montrer pour la voie O2-dépendante. Afin de mettre en évidence et caractériser le complexe putatif, nous combinerons des approches de biochimie, de biologie structurale et de biologie de synthèse qui seront guidées par des approches bio-informatiques visant à prédire les surfaces d’interactions entre protéines grâce à des analyses de co-évolution des acides aminés. Enfin, la quatrième tâche du projet emploie des approches bioinformatiques et phylogénétiques afin (i) de dresser un inventaire exhaustif des voies de production de quinones chez les bactéries, et (ii) de définir laquelle des voies UQ (O2-dépendante ou O2-indépendante) est apparue en premier, il y a vraisemblablement plus de 2 milliards d’années.

Tâche 1 : L’analyse génétique de la voie de biosynthèse de l’ubiquinone en anaérobie a mis en évidence un rôle de la voie aro/tyr pointant un rôle du préphénate comme donneur probable d’oxygène pour les réactions d’hydroxylation catalysées par UbiU-V. Les premiers résultats suggèrent un défaut des mutants ubiUV d’E. coli pour la phase précoce de colonisation de l’intestin de souris.
Tâche 2 : Le préphénate étant de nature instable, le partenaire 2 (P2) a exprimé et purifié le domaine Chorismate Mutase de PheA pour produire le préphénate in situ à partir de chorismate. Ceci facilitera le développement des tests enzymatiques avec UbiU-V pour lesquels des analogues de substrat à chaines courtes ont été synthétisés (farnésyl phénol et farnésyl catéchol). Par ailleurs, P2 a aussi démarré des essais cristallographiques du complexe UbiU-UbiV purifié. P3 a réalisé une analyse génétique des propriétés des protéines UbiU, UbiV et UbiT et une approche par suppresseurs multicopies a mis en évidence la capacité d’UbiU-V à remplacer les hydroxylases O2-dépendantes en aérobiose.
Tâche 3 : P1 a démontré que la protéine UbiT fait partie du complexe multiprotéique Ubi qui regroupe plusieurs protéines de la voie O2-dépendante et a entrepris de construire une collection de plasmides pour la surexpression des 8 gènes codant pour les protéines composant le complexe Ubi, afin de pouvoir le surproduire en vue de son étude structurale.
Tâche 4 : P1 a finalisé un outil bio-informatique d’annotation automatique des voies ubiquinone et ménaquinone dans les génomes bactériens, ce qui va permettre d’étudier la distribution de ces voies et d’entreprendre l’étude de l’histoire évolutive des voies ubiquinone.

La bonne avancée des recherches indique que les objectifs du projet devraient être atteignables pour la plupart.

P1, P2, P3 ont pu démontrer que les 3 gènes spécifiques à la voie O2-indépendante (ubiT-V) sont essentiels au processus de dénitrification chez la bactérie pathogène Pseudomonas aeruginosa et que la protéine UbiT est capable de lier la chaine polyprényl des intermédiaires de biosynthèse de l’ubiquinone. Ces résultats, publiés dans JBC en mai 2020 (doi : 10.1074/jbc.RA120.013748), établissent l’importance physiologique de la voie O2-indépendante et caractérisent le rôle de chaperon joué par UbiT.
Un état de l’art de la complexité et de la diversité des voies de biosynthèse de l’ubiquinone chez les bactéries a été réalisé par P1 et publié dans BBA - Bioenergetics en 2020 (doi : 10.1016/j.bbabio.2020.148259).

Les quinones isoprénoides sont essentielles à la physiologie cellulaire en transférant des électrons et protons dans les chaines respiratoires génératrices d’énergie et en fonctionnant dans des processus clés tels que la synthèse de l’hème ou de l’uracile. Escherichia coli et de nombreuses protéobactéries possèdent deux types de quinones isoprénoides : l’ubiquinone (UQ) et la (démethyl)ménaquinone (D)MK. Typiquement, UQ est considérée comme une quinone “aérobique” car elle participe à la respiration aérobique et sa biosynthèse dépend du dioxygène (O2) pour trois réactions d’hydroxylation. Au contraire, (D)MK est considérée comme une quinone “anaérobique”.
Au cours du projet AnaeroUbi financé par l’ANR (2015-2019), notre consortium a découvert qu’E. coli peut synthétiser UQ par une voie indépendante d’O2. Nous avons identifié trois gènes ubiT, ubiU et ubiV qui sont essentiels à la biosynthèse d’UQ en conditions anaérobiques. De plus, nous avons montré que la voie de biosynthèse d’UQ indépendante d’O2 est largement conservée chez les protéobactéries. Ainsi, nos résultats montrent qu’UQ n’est pas seulement une quinone aérobique puisque de nombreuses bactéries sont capables de synthétiser UQ quelle que soit la concentration environnementale en O2. Notre projet pluridisciplinaire O2-taboo est basé sur cette découverte et se structure autour de quatre tâches pour aborder des problématiques importantes :

1) Nous proposons d’évaluer la régulation de la biosynthèse d’UQ indépendante d’O2 et sa contribution à la physiologie bactérienne. Pour cela, nous cultiverons E. coli en laboratoire à différents niveaux d’O2 et aussi au sein d’un hôte naturel dans lequel les concentrations en O2 sont faibles. Nos résultats seront probablement applicables, au moins en partie, à de nombreuses bactéries anaérobies facultatives dont plusieurs sont pathogènes pour l’homme.
2) La nouvelle voie de biosynthèse d’UQ nécessite trois réactions d’hydroxylation indépendantes d’O2. Nous avons obtenus des résultats préliminaires qui suggèrent qu’UbiU et UbiV représentent une nouvelle classe d’hydroxylases indépendantes d’O2. Nous proposons d’élucider leur structure, leur mécanisme catalytique, le rôle de leurs centres Fe-S et d’identifier le donneur d’OH des réactions d’hydroxylation.
3) Dans la cellule, la biosynthèse d’UQ fait intervenir des substrats hydrophobes qui sont modifiés séquentiellement par plusieurs enzymes. Nous avons récemment montré que la biosynthèse d’UQ dépendante d’O2 prend place à l’intérieur d’un complexe multiprotéique dans lequel UbiJ et son domaine SCP2 lie les intermédiaires de biosynthèse hydrophobes. Nos données préliminaires suggèrent que la voie de biosynthèse d’UQ indépendante d’O2 s’organise elle aussi au sein d’un complexe multiprotéique avec la protéine UbiT et son domaine SCP2. Nous proposons de caractériser les composants du complexe et de définir leurs interactions en combinant des approches biochimiques et bioinformatiques.
4) Finalement, nous comptons étudier l’évolution de la voie UQ indépendante d’O2 pour évaluer si elle est apparue avant ou après la voie dépendante d’O2. Nos résultats pourraient remettre en cause la théorie actuelle selon laquelle l’apparition d’UQ sur Terre il y a environ 2,4 milliards d’années a nécessité des habitats riches en O2.

En combinant des approches complémentaires, le projet O2-taboo adresse des questions de premier ordre en physiologie microbienne, en biochimie cellulaire et en biologie évolutive. Globalement, nos résultats permettront des avancées significatives en élucidant (i) la régulation et l’importance physiologique d’une nouvelle voie conservée chez les protéobactéries, (ii) la fonction moléculaire et l’organisation supramoléculaire des protéines UbiT,U,V, (iii) une nouvelle chimie pour des réactions d’hydroxylation indépendantes d’O2, (iv) la distribution et l’évolution des voies de biosynthèse d’UQ chez les protéobactéries.