Circuits de modifications des ANRt: réseaux permettant une régulation dynamique des modifications – CiMoDyMo

Il est important de noter que même si les circuits de modifications sont probablement impliqués dans les voies de réponse au stress cellulaire, leur identification reste difficile. Une méthode intéressante pour identifier les circuits de modifications serait de pouvoir observer en temps réel le processus de maturation des ARNt à une résolution nucléotidique. L’idéal serait de pouvoir mener cette étude sur des molécules uniques afin d’avoir un contenu en information qui ne soit pas altéré par des effets de moyenne au niveau des populations. Les circuits de modifications potentiels pourraient alors être révélés par l’observation de l’introduction des modifications dans un ordre précis. Une telle étude de la maturation des ARNt en temps réel à une résolution nucléotidique sur molécule unique n’est cependant à l’heure actuelle pas réalisable d’un point de vue technique.

Au cours des dernières années, nous avons développé une méthodologie utilisant la RMN comme outil pour observer les événements de maturation des ARNt de manière continue et non perturbatrice. Nous avons également quantifié, par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS), la teneur en modification des ARNt totaux de levure préparés à partir des différentes souches délétées une-à-une des différentes enzymes de modifications. Dans ce type d’étude, la RMN et la spectrométrie de masse (MS) sont des techniques complémentaires, car la RMN permet d’observer de novo l’incorporation des modifications, alors que la MS permet de mesurer de façon quantitative le contenu en modifications des ARNt cellulaires.

Les travaux effectués nous ont permis d'explorer les circuits de modification des ARNt chez trois organismes modèles, la levure, E. coli et B. subtilis.

Chez la levure, l’étude s’est penchée sur la temporalité de l’incorporation de m¹A58, considérée comme précoce dans l’ARNtiMet, et comme tardive dans l’ARNtPhe. Grâce à l’analyse de substrats modifiés, nous avons montré que dans l’ARNtPhe, l’incorporation de T54 dépend de Ψ55, et que m¹A58 est stimulée individuellement par Ψ55 et T54, révélant un circuit de modification Ψ55 → T54 → m¹A58. Ce qui explique son introduction tardive. En revanche, m¹A58 peut être incorporée efficacement dans l’ARNtiMet non modifié, suggérant que certains ARNt sont de meilleurs substrats intrinsèques que d’autres pour cette modification. Ces résultats conduisent à proposer que les circuits de modification permettent de compenser la faible activité de certaines enzymes pour certains substrats, assurant ainsi une modification efficace de tous les ARNt.

Chez E. coli, la maturation de l’ARNtPhe a été étudiée par RMN en comparant un ARNt non modifié (produit in vitro) à un ARNt mature (surproduit dans les cellules). L’analyse a révélé une apparition hiérarchisée des modifications : Ψ55 et T54 sont introduites précocement, tandis que m⁷G46 apparaît plus tardivement. L’étude fonctionnelle via des extraits cellulaires de souches délétées d’enzymes spécifiques a permis de mettre en évidence un circuit de modification dans lequel Ψ55 stimule l’introduction de T54 et m⁷G46, expliquant leur ordre d’apparition et leur interdépendance.

Pour B. subtilis, un ensemble de développements techniques a été nécessaire pour permettre l’étude de la maturation des ARNt par RMN. Une méthode de surexpression d’ARNt marqués dans un plasmide adapté a été mise en place, permettant l’identification des signatures RMN des modifications sur l’ARNtPhe. De plus, l’étude de la modification T54 a nécessité la génération in situ du cofacteur CH₂–THF, instable et non disponible commercialement, indispensable à l’enzyme TrmFO spécifique à B. subtilis. La mise en œuvre de ces techniques ouvre désormais la voie à l’analyse fine des processus de maturation des ARNt dans cette espèce.

Même si ce projet n'a pour le moment pas permis de répondre à tous les questionnements initiaux, il nous a permis de mettre en place un certain nombre d'outils et a apporté un certain nombre de réponses quant au rôles potentiels des circuits de modifications. Nos travaux chez la levure nous ont ainsi permis de proposer qu’un des rôles potentiels des circuits de modification serait de permettre la modification à la fois des bons et des mauvais substrats ARNt. Les circuits de modification apporteraient ainsi une solution au problème que constitue le fait d’avoir à la fois de mauvais et de bons substrats qui nécessitent tous in fine d’être modifiés.

L'ensemble des résultats obtenus et outils mis en place lors de ce projet sont fondamentaux pour la poursuite de futurs projets de recherche sur les circuits de modifications. Ils montrent en effet que la méthodologie que nous avons développée pour étudier la maturation des ARNt de levure, est transposable à d’autres organismes et peut être utilisée pour étudier la maturation d’autres ARNt — par exemple des ARNt bactériens. Ils confirment également que des circuits impliquant des modifications du coeur des ARNt peuvent être découverts — chez d’autres organismes que la levure — grâce à la combinaison de notre approche d’étude RMN résolue dans le temps, et de l’utilisation des souches délétées une-à-une des différentes enzymes de modification. Dans l'ensemble, cela ouvre des perspectives prometteuses pour continuer l'étude des circuits de modification des ARNt, en vue de comprendre leur rôle potentiel et leur implication dans la réponse aux changements environnementaux.

La maturation des ARN comprend des modifications chimiques de leurs nucléotides. Parmi les différentes familles d'ARN, les ARN de transfert (ARNt) présentent non seulement la plus grande variété de modifications, mais également la plus grande densité de modifications par transcrit. Alors qu'un modèle simple serait que les modifications sont introduites dans les ARNt indépendamment les unes des autres, plusieurs circuits de modification, dans lesquels une ou plusieurs modifications stimulent ou régulent négativement la formation d'une autre modification, ont été identifiés. De plus, en réponse aux changements environnementaux, une adaptation dynamique des modifications des ARNt se produit. Ce projet a pour objectif d'étudier la relation entre les circuits de modifications dans les ARNt et l'adaptation dynamique des modifications des ARNt en réponse aux changements environnementaux.