Décrypter les interactions des Synthases de Cyclodipeptides avec leurs substrats aminoacyl-ARNt pour générer des enzymes modifiées – Flex-Pep

Les enzymes impliquées dans la biosynthèse des produits naturels sont des catalyseurs attractifs pour la production de molécules d’intérêt thérapeutique. Effectuer l'ingénierie de ces enzymes est une stratégie prometteuse pour accéder à des molécules aux propriétés nouvelles ou optimisées. Cependant, comprendre le fonctionnement de ces enzymes est une prérequis indispensable à tout effort de génie enzymatique.
Les synthases de cyclodipeptides (CDPS) constituent une famille d’enzymes impliquées dans la biosynthèse des dicétopipérazines (DKP), des molécules aux propriétés pharmacologiques diverses et remarquables. Les CDPS utilisent deux aminoacyl-ARNt (AA-ARNt), détournés de leur rôle canonique dans la synthèse des protéines, pour catalyser la formation du noyau DKP de nombreux cyclodipeptides. Le partenaire 1 a récemment montré que les CDPS sont capables d'incorporer des acides aminés non canoniques (ncAAs) dans leurs produits, ce qui a permis de produire biologiquement environ 200 DKP non canoniques. Cependant, un grand nombre des ncAA-ARNt testés n'ont pas été reconnus comme substrats par les CDPS. L'étude des bases moléculaires régissant la spécificité de substrat de ces CDPS, c'est-à-dire la compréhension fine des interactions entre les CDPS et les AA-ARNt, est essentielle pour générer des CDPS dotées de nouvelles spécificités de substrat.
Les CDPS ont été largement étudiées pour comprendre le cycle catalytique qu’elles utilisent. Ce cycle débute par l’interaction d’un premier AA-ARNt et sa partie aminoacyle est transférée sur l’enzyme pour donner un intermédiaire aminoacyl-enzyme. Puis, le deuxième ARNt interagit et sa partie aminoacyle est à son tour transférée pour donner un intermédiaire dipeptidyl-enzyme. La partie dipeptidyle subit alors une cyclisation intramoléculaire conduisant à la formation du cyclodipeptide final. Par contre, tous les résultats biochimiques et structuraux acquis depuis plusieurs années tant par le partenaire 1 et ses collaborateurs que d’autres groupes n’ont pas permis d’obtenir des informations suffisamment précises et utilisables pour comprendre la spécificité de substrat des CDPS, en particulier en ce qui concerne leur interaction avec la partie ARNt des substrats.
Flex-Pep est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les bases moléculaires régissant l’interaction des CDPS et de leurs deux substrats, ceci afin d’entreprendre une ingénierie enzymatique conduisant à des CDPS dotées de nouvelles spécificités de substrat pour produire de nouveaux cyclodipeptides. Pour atteindre cet objectif, les partenaires du projet vont travailler sur un nouveau groupe de CDPS qui ont l’avantage d’utiliser deux substrats différents, permettant ainsi de discriminer l’interaction du premier et du deuxième substrat. Ils vont étudier l’interaction de ces CDPS avec des analogues de substrats qui ont des parties ARNt les plus courtes possibles (appelés analogues AA-miniARN), ce qui devrait permettre de faciliter les différentes études. Les analogues AA-miniARN vont être synthétisés en utilisant des flexizymes, à savoir des ribozymes dotés d'une activité d'acylation très versatile. Les études seront conduites en utilisant des techniques variées (essais enzymatiques, ITC, switchSense, ...) qui devraient permettre de caractériser les interactions se produisant au sein des couples appropriés « CDPS/analogue AA-miniARN » et de sélectionner les meilleurs couples pour des études cristallographiques ou de RMN. Enfin, les partenaires utiliseront les connaissances acquises pour entreprendre une ingénierie des CDPS visant à obtenir des enzymes incorporant des ncAAs. Ces nouvelles molécules seront testées ultérieurement pour leurs activités biologiques et pharmacologiques. Par ailleurs, la stratégie utilisée dans ce projet pourra être appliquée à l'étude des autres voies de biosynthèse de produits naturels utilisant des AA-ARNt qui sont en train d’émerger.