Dépasser les limites des méthodes existantes de criblage à haut débit et de caractérisation des canaux ioniques grâce au transfert d’énergie en résonance de bioluminescence – CANALBRET

Au cours des quinze dernières années, les approches basées sur le transfert d'énergie par résonance (RET) ont offert de nouvelles opportunités pour mesurer l'activité de protéines en temps réel. Ces techniques sont basées sur le transfert d'énergie non radiatif entre un donneur d'énergie et un accepteur d'énergie fluorescente compatible. Parmi les diverses techniques RET, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (BRET) est une méthode populaire, facile d'utilisation, et de plus en plus largement utilisée pour étudier l'activité des protéines dans les systèmes vivants. L'indépendance par rapport à une source d'énergie externe pour l'excitation du donneur donne au BRET certains avantages par rapport aux techniques connexes telles que le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET). Grâce à ces avantages, les tests BRET ont été largement mis en œuvre pour le criblage de médicaments ciblant les récepteurs couplés aux protéines G et les kinases .
Nous avons récemment démontré que les sondes BRET intramoléculaires et intermoléculaires pourraient être utiles pour mesurer l'activation des canaux ioniques TRPV en temps réel sur des cellules vivantes en fonction de la température ou de l' activation chimique. Ces sondes BRET innovantes mesurent des événements moléculaires liés à l'activation des canaux ioniques (changements conformationnels et dynamique des interactions protéine-protéine) qui ne sont pas mesurables en utilisant des techniques de références comme les sondes fluorescentes conventionnelles oula technique du patch-clamp. Nos sondes ouvrent donc ouvert de nouvelles perspectives pour le développement de d'essais cellulaires simples susceptibles d'améliorer l'efficacité du criblage de médicaments ciblant les canaux ioniques.

A mi-parcours, nous avons validé de nouveaux concepts de sondes BRET intramoléculaires ciblant les canaux ioniques et réalisé un premier criblage d'une banque de médicament en prenant comme modèle d'étude le canal TRPV1.

Le projet CANALBRET bénéficie d’une excellente dynamique, fruit d’une interaction très fructueuse entre les partenaires académiques ainsi qu’avec notre partenaire privé. Les expérimentations, bien qu’accusant un léger retard dû à l’adaptation à la crise COVID, ne rencontrent pas de problèmes techniques majeurs. Des résultats sortent donc de manière régulière de nos interactions. Plusieurs publications peuvent être envisagées pour l’années à venir.
Les perspectives immédiates concernent la réalisation d'un deuxième crible, l'approfondissement de nouveaux concepts en pharmacologie moléculaire des canaux ioniques mis à jour grâce aux différentes générations de sondes que l'on a mis au point, et l'exploration des effets des contraintes physiques sur l'activité des canaux ioniques.

1. Chappe et al. (2021). Molecular Pharmacology. En révision
2. Brevet n°EP 20163892.1. Déposé le 18 Mars 2020. Titre : Novel ion conducting channel fusion subunits and methods of use thereof.

Les canaux ioniques sont des protéines membranaires qui permettent le passage sélectif de la membrane cellulaire par des ions (Na+, Ca2+, K+, Cl-, …) suivant leurs gradients électrochimiques. Du fait de leur implication dans de nombreuses pathologies, les canaux ioniques représente la troisième famille de cibles thérapeutiques la plus importante après les kinases et les récepteurs couplés aux protéines G. Les ventes mondiales de médicaments ciblant les canaux ioniques représentent un marché de 12 milliards de dollars US, soulignant l'importance de ces protéines en thérapie. Néanmoins, malgré cela, les canaux ioniques restent sous-exploités en tant que cibles médicamenteuses et seuls 20% des canaux ioniques sont actuellement exploités commercialement (parmi plus de 300 membres connus). Historiquement, en effet, le criblage à haut débit de médicaments candidats sur les canaux ioniques s'est révélé techniquement difficile et reste très coûteux. Au cours des quinze dernières années, les approches basées sur le transfert d'énergie par résonance (RET) ont offert de nouvelles opportunités pour mesurer l'activité d'un nombre croissant de protéines, et ce en temps réel et sur cellules vivantes. Ces techniques sont basées sur le transfert d'énergie non radiatif entre un donneur d'énergie et un accepteur d'énergie fluorescent compatible. Dans ces techniques de RET, l'efficacité du transfert d'énergie est intrinsèquement dépendant de la proximité moléculaire (environ 100 Å) et de l'orientation entre les molécules donneuses et acceptrices d'énergie. Parmi les différentes techniques de RET, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (BRET) est une méthode populaire, pratique et peu onéreuse, qui est largement utilisée pour étudier l'activité des protéines dans les cellules vivantes. En particulier, le test BRET a été largement mis en œuvre dans le cadre de criblage de médicaments ciblant les récepteurs couplés aux protéines G et les kinases. Notre consortium a récemment construit et caractérisé des sondes BRET intra- et intermoléculaires ciblant les canaux ioniques P2X2 ou TRPV1/3/4, et qui permettent la mesure de l'activation chimique de ces canaux ioniques en temps réel et sur des cellules vivantes. Ces sondes BRET innovantes permettent de mesurer la dynamique des changements de conformation de ces canaux et de leurs interactions protéine-protéine. Ces mécanismes moléculaires ne sont pas mesurables à l'aide des techniques classiques d'analyse des canaux ioniques (patchclamp ou sonde fluorescente). Nos sondes BRET ont donc ouvert de nouvelles perspectives pour le développement de tests cellulaires simples qui pourraient améliorer l'efficacité de la recherche de nouvelles molécules actives à destination des canaux ioniques. L'avènement de telles sondes sur d'autres canaux ioniques permettra de promouvoir le développement de tests BRET à forte valeur ajoutée pour la découverte de médicaments dans le domaine des canaux ioniques ainsi que l'établissement de méthodes d'analyse innovantes pour la recherche académique. Renforcé par l'interaction de trois groupes de recherche universitaires expérimentés et d'une entreprise privée, le projet CANALBRET (i) étendra la preuve de concept des sondes BRET à d'autres canaux ioniques que ceux appartenant aux seules familles P2X et TRP (ii) ) démontrera la puissance de la technologie CANALBRET par rapport aux techniques conventionnelles utilisées pour le criblage de médicaments ciblant les canaux ioniques et (iii) approfondira les connaissances fondamentales de l'activation de canaux polymodaux par des stress physiques (étirement, pression température), ainsi que la dynamique de leurs interactions protéine-protéine.