Caractérisation des IgG en vue du diagnostic d’infections congénitales – IgName

À ce jour, la caractérisation des Ab par MS s’est appuyée sur des stratégies protéomiques bottom-up qui impliquent une digestion enzymatique avec de la trypsine ou de multiples protéases et une analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem. Bien que de telles méthodes soient bien établies pour l’analyse conventionnelle des protéomes, les répertoires d’Abs présentent plusieurs obstacles techniques importants qui doivent être traités pour une identification réussie. En effet, pour le domaine variable, une bibliothèque de séquences VH et VL spécifique à l’échantillon est nécessaire pour la recherche dans la base de données et l’identification des peptides, car les gènes Ab ne sont pas directement codés dans la lignée germinale. Dans notre cas, pour le domaine constant, l’identification d’un Ab sans ambiguïté dépend de l’observation d’une combinaison de peptides spécifiques. L’approche protéomique middle-down repose sur une digestion enzymatique limitée pour générer moins de peptides et de plus grande taille que la protéomique bottom-up conventionnelle. Pour l’analyse des sous-unités, les mAbs sont clivés à l’aide de diverses protéases pour générer Fab, F(ab')2 ou Fc. Comme preuve de concept, nous avons montré que cette stratégie peut être appliquée avec succès pour identifier spécifiquement 5 allèles protéiques IGHG sur 8 provenant de moins de 50 µL de sérum provenant d’un donneur hétérozygote.

Plusieurs antigènes ont été identifiés et sont en cours de validation avant l’expression des protéines recombinantes
La protéolyse pour la récupération des fragments Fc/2 est optimisée
Les colonnes LC dédiées maison peuvent être utilisées pour la miniaturisation de l’analyse sérique du nouveau-né
La séparation de Fc/2 de LC est presque atteinte
La couverture de la séquence protéique par MS/MS a atteint 93 %
Un nouveau script a été généré pour alimenter une base de données dédiée à des fins protéogénomiques
Un protocole de travail complet pour l’étude de glycosylation a été développé

La génération de cartouches miniaturisées d’affinité fonctionnalisée est en cours de développement. Elles seront fonctionnalisées avec des protéines 1) antigène pour capturer des IgG spécifiques 2) lectine pour capturer les espèces glycosylées
Alternativement, nous mettrons en œuvre la technologie des nanobodies pour une purification Fc/2 ultérieure.

NA

Le diagnostic postnatal de la toxoplasmose congénitale causée par le parasite Toxoplasma gondii est impératif pour assurer des soins médicaux optimaux. Ainsi, l'identification précoce des anticorps spécifiques développés par le nouveau-né revêt une importance cruciale. Ceci est un défi en raison de leur présence conjointe avec les immunoglobulines G (IgG) maternelles dans le sérum du nouveau-né. La présente proposition vise à identifier les IgGs du nouveau-né spécifiques de l'agent pathogène. Pour atteindre cet objectif, nous explorerons les signatures individuelles portées par la chaîne lourde de l'IgG et résultant des polymorphismes de plusieurs acides aminés. Nous utiliserons des méthodes de purification par affinité, un dispositif adapté pour miniaturiser ces protocoles et la spectrométrie de masse en mode middle-down pour une caractérisation protéogénomique des IgG. Une cartographie de la glycosylation de l'IgG sera également réalisée. De nombreux défis scientifiques seront relevés : (1) nous proposerons une stratégie opérationnelle pour la purification des IgGs spécifiques des agents pathogènes; (2) nous développerons un système protéolytique pour libérer les séquences discriminantes les plus courtes permettant d'identifier les variants peptidiques; (3) nous intégrerons les mises à jour des informations génomiques les plus récemment disponibles dans le référentiel public avec des approches dédiées à la protéomique intermédiaire et ciblées dans une stratégie de protéogénomique; (4) nous analyserons le profil de glycosylation afin d'étudier une corrélation potentielle avec la spécificité des IgGset leur origine maternelle ou infantile. Nous utiliserons des échantillons clés d’ores et déjà caractérisés pour valider notre approche, que nous appliquerons ensuite à des échantillons de couples mère (sang périphérique)/nouveau-né (sang de cordon) provenant de deux cohortes existantes, française et béninoise, axées sur la toxoplasmose. Les échantillons d'intérêt sont ceux prélevés dans les cas où la mère a eu une primo-infection toxoplasmique pendant la grossesse induisant une séroconversion et où le nouveau-né est suspecté d'avoir contracté l'infection in utero. Pour sa réussite, la stratégie sera optimisée de manière à atteindre la sensibilité requise pour être directement compatible avec la quantité infime de sang périphérique qui peut être prélevée chez un nouveau-né (volume total maximum de sérum 100 µL). Ce projet bénéficiera de l'expertise d'équipes complémentaires, dans les études immunologiques des maladies congénitales et de la protéomique middle-down. Il sera accompagné par trois structures particulièrement adaptées : l'IRD qui coordonne la mise en place de cohortes d'intérêt, la plateforme de protéomique de l'ESPCI avec notamment un spectromètre de masse de type UVPD MS/MS à haute résolution obtenu en 2018 grâce à un financement régional, et le Labex IPGG pour la microfluidique. Les deux partenaires travaillent ensemble depuis 2011, ce qui a été officialisé par un programme de recherche en collaboration entre l'IRD et l'ESPCI. A terme, cette rupture technologique ouvrira la voie à de nombreuses applications telles que le diagnostic et le suivi d'autres maladies congénitales parasitaires (notamment la maladie de Chagas), ou plus généralement d'autres infections d'origine bactérienne ou virale, ainsi que d'autres pathologies associées à des désordres auto-immuns comme le diabète de type 1 insulino-dépendant.