Identification à l'échelle du génome des sites de fixation à la base exacte des ligands de l’ADN G4 – NEMESES

Deux voies de synthèse en une ou deux étapes respectivement ont été développées pour la préparation de ligands G4 non alkylants et alkylants capables de cibler sélectivement l'ADN G-quadruplex en exploitant la chimie click. Leur capacité d’interagir avec les structures secondaires de l’ADN G-quadruplex a été évaluée en utilisant différents tests biophysiques tels que le FRET-melting et le test G4-FID, et leur sélectivité vers les ADN G4 a été testée en présence d'un grand excès de d'ADN duplex, utilisé comme compétiteur. L'efficacité de l'approche synthétique en deux étapes (fonctionnalisation in situ) a été validée in vitro, en présence de la cible biologique, et dans les cellules grâce au le développement d'une technique de visualisation capable de suivre la distribution du ligand G4 dans les sous-compartiments cellulaires. En ce qui concerne les ligands alkylants de l’ADN G4, des assais biochimiques (analyses sur gel) ont été réalisés pour l'identification de leur capacité d’alkyler efficacement plusieurs structures G4 avec de topologie différente. Les réactions d'alkylation ont été optimisées de façon intensive.

Au cours des dix-huit premiers mois du projet, tous les ligands G4 non alkylants ont été synthétisés avec succès en suivant en parallèle des voies de synthèse en une et deux étapes. La capacité des composés non alkylants à se lier à l'ADN G-quadruplex a été analysée par des essais biophysiques, notamment en employant le FRET-melting et le G4-FID et leur sélectivité validée en présence d'un large excès d'ADN duplex. La voie de synthèse en deux étapes, réalisée en présence de l’ADN G4, a été largement étudiée et optimisée. Des études préliminaires ont montré la capacité des ligands à pénétrer en milieu cellulaire et ont permis de suivre leur distribution cellulaire par immunofluorescence. 14 composés capables de former des liaisons covalentes avec l'ADN G-quadruplex ont été synthétisés efficacement en suivant exclusivement l'approche de synthèse en deux étapes. Les études biophysiques sont en cours. De même les essais biochimiques en présence de différentes structures de l’ADN G4 ainsi que l'efficacité d'alkylation sont actuellement à l'étude.

La reconnaissance et la résolution des structures de l’ADN G-quadruplex sont désormais de la plus haute importance dans la génétique moléculaire moderne, comme le montre le nombre toujours croissant de publications sur ce sujet. Le projet de recherche proposé, impliquant de nouveaux outils moléculaires capables de reconnaitre et alkyler les structures G-quadruplexes, permettra l’identification systématique à l'échelle du génome des sites de fixation des ligands G4 et, par conséquence, des domaines riches en G qui sont susceptibles de se replier et former ces structures dans les cellules vivantes. Jusqu'à présent, seuls quelques exemples de ligands G4 employés pour isoler les structures G4 ont été présentés dans la littérature. Cependant, tous ses ligands capturent l'ADN ou l'ARN G4 à partir d'extraits cellulaires ne donnant aucune information sur l'accessibilité des G4 dans un système dynamique tel qu'une cellule vivante. C'est pourquoi nous proposons d'exploiter des ligands G4 alkylants capables de reconnaître et de se lier en façon covalente aux G4s dans un système dynamique. De plus, en utilisant ces nouveaux ligands, nous serons en mesure de concevoir et de développer une nouvelle méthodologie de séquençage basé sur l'immunoprécipitation chimique (Chem-IP-Seq) pour cartographier les sites de fixation des ligands de l’ADN G4 avec une résolution au niveau du nucléotide. La combinaison de la nouvelle méthodologie Chem-IP-Seq avec un séquençage massif de l'ADN permettra de mieux comprendre la génération de G4 dans les cellules et leur accessibilité par les ligands G4, ce qui rend notre stratégie sans précédent. La cartographie à l'échelle du génome des sites de fixation du ligand G4 dans les cellules vivantes ouvrira la voie à une analyse transcriptomique ciblée qui permettra d'identifier les effets produits par le repliement et le dépliement des G4 sur l'expression des gènes.

T. Masson, C. Landras Guetta, E. Laigre, A. Cucchiarini, P. Duchambon, M.-P. Teulade-Fichou, D. Verga*. “BrdU immuno-tagged G-quadruplex ligands: a new ligand-guided immunofluorescence approach for tracking G-quadruplexes in cells”. Submitted Angew. Chemie Int. Ed. (April 2021).

L’ADN contenant des répétitions de 3 ou 4 guanines successives peut former spontanément des structures supramoléculaires nommées G-quadruplex (G4s). Comme ces structures non-canoniques sont susceptibles de se former dans toutes les régions riches en guanines, ceci suggère qu’elles peuvent jouer un rôle important dans les processus biologiques clés. Il est actuellement proposé que les G4 puissent représenter un troisième niveau de régulation génétique et les données accumulées suggèrent que les G4 peuvent être liées aux maladies humaines ; par conséquent, ces structures font l’objet d'un nombre considérable d’études. Cependant, la nature dynamique de ces structures rend leur identification extrêmement difficile dans les cellules vivantes et déterminer leur importance biologique représente donc un véritable défi.
La connaissance associée aux structures G4, en particulier leur localisation dans le génome et leur dynamique dans les cellules, sont des aspects importants pour la poursuite de l'étude des fonctions du G4 et de leur implication dans la biologie et la médecine. Le but de ce projet est de développer et utiliser des techniques qui vont permettre de surmonter les limitations actuelles de la cartographie des G4 dans les cellules et d'identifier des loci spécifiques des G4 au niveau du génome. Ce projet développera des approches innovantes pour explorer les relations structure/fonction de l’ADN basées sur le couplage de nouveaux agents chimiques fonctionnels de piégeage (ligands de G4) avec un séquençage de l’ADN à haut débit pour i) cartographier directement et globalement les structures G4 dans le cellules et ii) révéler leurs rôles fonctionnels et régulateurs dans les cellules de mammifères.
Ces objectifs seront atteints par la synthèse de petites molécules, non-alkylantes et alkylantes, spécifiquement modifiées et sélectives pour les G4s. Elles permettront l’identification systématique à l’échelle du génome des sites de fixation des ligands G4, et celle des domaines riches en guanines formant des quadrulexes dans les cellules vivants. De plus, l’utilisation de ces nouveaux ligands rendra possible la conception et le développement d’une nouvelle méthode de séquençage chimique combinée à l’immunoprécipitation (Chem-IP-Seq) pour cartographier les sites de fixation des ligands G4 à la base exacte.
Notre approche combinée devrait apporter des réponses aux questions actuelles concernant les séquences consensus formant des G-quadruplexes in vivo, contribuant ainsi à une meilleure compréhension de leur accessibilité, leur dynamique et leur rôles régulateurs et en particulier, leurs liens avec des mutations associées à des maladies. Pour la première fois, la cartographie des sites de fixation des ligands G4 à la base exacte permettra de lier précisément la réponse cellulaire à une région génomique. Le but général de ce travail est de valider les G4s comme des cibles thérapeutiques et d’établir une cartographie du transcriptome dont les réponses biologiques dépendent du repliement et dépliement des G4s.