Preuve de concept pour la fonctionnalisation des lignines par l'application de traitements enzymatiques laccase-déshydrogénase pour l’obtention de matériaux biosourcés – FuncLIPRO
Proof of concept for the functionalization of lignins by applying laccase-dehydrogenase enzymatic treatments in biobased materials applications
Le projet FuncLIPRo a été élaboré comme une preuve de concept dans le cadre du renouveau industriel et plus particulièrement pour améliorer l'efficacité des procédés industriels. Il a pour objectif d’approfondir notre compréhension des enzymes dégradant la lignine (LDE) et notamment des laccases et déshydrogénases fongiques, et du mécanisme de déconstruction et de modification enzymatique de la lignine.
Preuve de concept de l'utilisation des laccases pour transformer des sous-produits sous-valorisés
Le projet a pour objectif d’apporter la preuve de concept de l'utilisation des laccases pour transformer des sous-produits sous-valorisés, c'est-à-dire les lignines générées par les industries de la pâte et du papier, en adhésifs verts, en films protecteurs de revêtement et en nouveaux composites agro-sourcés.<br /><br />Objectifs scientifiques : comprendre la modification de la lignine :<br />le principal objectif scientifique de FuncLIPRO (WP3) est de comprendre et de maîtriser la modification de la lignine par les enzymes de modfication des lignines (LDE) (polymérisation, dépolymérisation et caractéristiques chimiques et structurales qui en résultent), et plus spécifiquement : (i) comprendre les différents mécanismes des laccases (LAC) à faible et à fort potentiel redox ; (ii) comprendre les synergies LAC/GDH ; (iv) comparer les traitements par les LDE effectués sans ou avec des médiateurs redox ; (v) évaluer l'effet des traitements par LDE sur la structure et la taille des lignines modifiées ; (vi) corréler les traitements par LDE avec les fragments chimiques (réactifs) générés sur les lignines.<br /><br />Objectifs technologiques : matériaux biosourcés :<br />1. Alternatives vertes aux résines phénol-formaldéhyde (PFR). Au cours des dernières décennies, de nombreuses recherches ont été menées pour remplacer partiellement des ratios variables (35% à un maximum de 50%) de phénol-formaldéhyde (PF) par différentes lignines industrielles. Cependant, au-delà de 50% de substitution, les propriétés techniques des panneaux résultants ne répondaient toujours pas à la norme européenne standard, même avec des approches alternatives prometteuses. Sur la base de cette étude et de nos résultats, les LDE choisis pour atteindre les objectifs ambitieux de FuncLIPRO ont le potentiel de fournir des lignines activées par voie enzymatique qui peuvent remplacer totalement les PFR d'origine fossile, et réduire les risques associés à l'utilisation du formaldéhyde, une substance cancérigène, mutagène et reprotoxique. <br />2. Films de revêtement protecteur. En utilisant des lignines modifiées par voie enzymatique, nous espérons pouvoir générer de nouveaux revêtements protecteurs multifonctionnels, qui amélioreront la stabilité du bois contre le vieillissement et le mouillage par l'eau, en augmentant par exemple l'hydrophobie de la surface, le blocage des UV, les propriétés anti-oxydantes et antimicrobiennes.<br />3. Composites agro-sourcés. Le troisième objectif technique de FuncLIPRO est la conception de composites biosourcés utilisant des sous-produits agro-industriels et des lignines industrielles comme matrice. Lors de la préparation d'agro-composites à haute teneur en lignine, des fissures se forment souvent au sein de la matrice de lignosulfonate et à l'interface entre la matrice et les particules de sous-produits agro-industriels. Le consortium FuncLIPRO fournira des lignines techniques «modèles«, ainsi que des lignines modifiées par LDE, fournissant de nouvelles formulations d'agro-composites.
FuncLIPRO est un projet transdisciplinaire, porteur d'enjeux scientifiques, technologiques et financiers, basé sur des recherches dans les domaines de la biochimie (production de protéines, caractérisation fonctionnelle et structurale des enzymes, ingénierie des protéines, science des biopolymères), de la chimie (analyse analytique, organique et structurale, synthèse des polymères, science des matériaux) et de l'ingénierie des procédés (conception des procédés, formulation des produits, évaluations économiques et environnementales).
Pour la production d'enzymes, elles peuvent être produites soit dans un champignon sauvage (Pyncoprous cinnabarinus), soit en utilisant des hôtes hétérologues, par exemple Aspergillus niger.
Afin d'étudier les déterminants de l'enzyme liés à son activité sur les lignines, des cristaux d'enzymes seront produits. Les conditions de cristallisation ont déjà été trouvées pour PcGDH et pour une PcADD. P1 est membre d'un «BAG« (Block Allocation Group) qui accordera l'accès aux faisceaux de rayons X, afin de mener des expériences de diffraction aux sources synchrotron nationales (Soleil - Paris et ESRF - Grenoble).
Les enzymes seront appliquées à la lignine dans un pH spécifique pour permettre une bonne activité des enzymes de modification de la lignine et la lignine sera analysée par différentes techniques. Parmi les outils analytiques utilisés, un screening de l'efficacité du traitement sera effectué, en comparant les échantillons obtenus à partir de lignines natives et traitées enzymatiquement, en termes de (i) distribution de masse molaire (chromatographie d'exclusion de taille, P2) et (ii) contenu en groupes fonctionnels (groupes hydroxyles libres analysés par 31P NMR, P3). En outre, pour les fractions présentant des profils sélectionnés (c'est-à-dire des fragments de lignine homogènes contenant des fragments phénoliques libres), l'identification et la caractérisation des produits de dégradation de la lignine seront effectuées par LC-MS, GC-MS et RMN (P3).
Les meilleures conditions enzymatiques seront utilisées pour fournir trois applications différentes, remplaçant des composés chimiques non renouvelables et développant des approches respectueuses de l'environnement (adhésifs, film de revêtement et matériaux agro-sourcés). En outre, des données seront collectées à l'échelle du laboratoire afin de permettre l'évaluation de l'impact environnemental et des coûts.
WP2 Production et caractérisation des enzymes et des lignines
(1) Trois enzymes de P. cinnabarinus ont été produites dans des quantités suffisantes pour conduire le projet: laccase (LAC), oligosaccharide déshydrogénase (ODH) et 2 aryl acool déshydrogénases (P1: BBF). L’étude structure-fonction de l’ODH, considérée auparavant comme une glucose déshydrogénase, suggère que les substrats physiologiques pourraient provenir de la dégradation des hémicelluloses (2) Les lignines organosolves (lignines les plus proches des lignines naturelles) ont été préparées par l’Institut TNO sous MTA et les lignines kraft (résidus du secteur papetier) par le FCBA (P4).
WP3 Analyses des lignines à partir des expériences de mise en œuvre des enzymes sur les lignines
(1) Des essais préliminaires ont été effectués sur fibres de bois traités par la laccase pour la fabrication à petite échelle par voie humide de panneaux de fibres durs. Les résultats démontrent que le prétraitement des fibres d'épicéa avec des systèmes laccase-médiateur avant le pressage à chaud présente un impact sur la qualité des fibres de bois et permet d’améliorer la résistance mécanique des panneaux obtenus tout en utilisant les plus faibles charges d'enzyme.
(2) En premier temps, nous avons mis en œuvre la laccase de P. cinnabarinus en faisant varier, le pH, la concentration de l’enzyme et le temps d’incubation de l’enzyme sur la lignine organosolve (P1 BBF). L’effet de la laccase sur ces lignines a ensuite été évalué par des techniques de RMN du phosphore (teneur en OH libre), HP-SEC (taille des lignines résultantes), FT-IR (fonctions des composés de la lignine) et Tg (température de transition vitreuse) et aucune modification significative n’a été enregistrée.
(3) Nous nous sommes tournés dans un second temps sur les lignines krafts préparées par le FCBA (P1 BBF, P2 FCBA). Pour exemple, une première analyse à composante principale (ACP) à partir de tests FT-IR (P2 FAREa permis de mettre en évidence l’effet pH très visible en FT-IR ainsi qu’un possible effet du médiateur rédox, 1-hydroxybenzotriazole (HBT). Trois tests statistiques ANOVA ont ensuite été réalisés sur les données FT-IR et ont permis de dire que le traitement enzymatique qui apporte la plus grande différence significative est celui correspondant au traitement avec la laccase et d’HBT.
Des tests effectués par la technique de HP-SEC (P3: IJPB) ont permis de conforter ces résultats.
Enfin, des mesures de Tg (P5: IP) sur ces lignines, modifiées par laccase, permettent de dire que les changements de Tg les plus significatifs correspondent aux échantillons traités par la laccase. Le médiateur HBT a un effet qui s’additionne à celui de la laccase lorsque les deux sont utilisés simultanément sur la lignine.
WP4 Applications des lignines modifiées enzymatiquement
De premiers tests d’applications ont été effectuées par P2 (FARE) et P4 (FCBA).
pour la préparation de films de revêtement et d’adhésifs (P4), et de matériaux agrosourcés.
Une prochaine publication est en cours d’écriture pour valoriser les résultats concernants la caractérisation de lignines et extractibles modifiés enzymatiquement et le développement d’adhésifs. La prochaine étape sera de mettre en œuvre la laccase avec les déshydrogénases avec un traitement séquentiel ou en une seule étape (mélange des enzymes).
1. Sona Garajová, Ilabahen Patel, Anne Lomascolo, Frédéric Legée, Laurent Cézard, Betty Cottyn, Michaël Lecourt, Emmanuel Bertrand, Giuliano Sciara, Sandra Tapin-Lingua, Stéphanie Baumberger, Craig B. Faulds & Eric Record Treatment of wood fibres with laccases: improved hardboard properties through phenolic oligomerization. Eur. J. Wood Prod. 79, 1369–1382 (2021). doi.org/10.1007/s00107-021-01720-3
2. 1. Cerutti G, Gugole E, Montemiglio LC, Turbé-Doan A, Chena D, Navarro D, Lomascolo A, Piumi F, Exertier C, Freda I, Vallone B, Record E, Savino C, Sciara G. Crystal structure and functional characterization of an oligosaccharide dehydrogenase from Pycnoporus cinnabarinus provides insights into fungal breakdown of lignocellulose. Biotechnol Biofuels. 2021 Jul 22;14(1):161. doi: 10.1186/s13068-021-02003-y. PMID: 34294139; PMCID: PMC8296622. biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-021-02003-y
Les lignines, second polymères après la cellulose, sont peu valorisées en tant que combustible pour produire de l’énergie. Ce projet vise à modifier enzymatiquement différentes lignines pour produire des composés verts bio-sourcés pour les applications « bois » dans un processus respectueux de l'environnement et d'économie d'énergie. Nous proposons d'exploiter des enzymes issues de recherche interne en comparaison avec des enzymes industrielles pour activer différentes lignines (organosolv, lignosulfate, Kraft) obtenues à partir de deux essences de bois (pin et bouleau) et d’utiliser ces lignines pour produire des adhésifs, des matériaux bio-sourcés et des films protecteurs pour le secteur de l’ameublement. Le mode d'action des enzymes oxydantes sera étudié à l'aide d'une approche multidisciplinaire comprenant la chimie analytique, la synthèse organique et la spectroscopie. L'impact environnemental et le coût économique des composés bio-sourcés seront également étudiés.
Coordination du projet
Eric Record (INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - Centre de recherche PACA - Biodiversité et Biotechnologie Fongique)
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
Partenaire
INRA PACA - BBF INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - Centre de recherche PACA - Biodiversité et Biotechnologie Fongique
FARE Fractionnement des Agro-Ressources et Environnement
IJPB INRA Institut Jean-Pierre BOURGIN
IP INSTITUT PASCAL
FCBA Institut Technologique FCBA
Aide de l'ANR 478 048 euros
Début et durée du projet scientifique :
décembre 2019
- 36 Mois
