Mesure et cartographie de la richesse des virus des plante à l'échelle de l'écosytème – PHYTOVIRUS

Approches de métagénomique virale :

Plusieurs approches méthodologiques concernant la métagénomique virale ont été entreprises depuis le début du projet.
• La robustesse du protocole complet de métagénomique virale (séchage et broyage des échantillons ; extraction, amplification, séquençage et analyse bioinformatique des séquences) est actuellement testée.
• La technique de séquençage « Nanopore » a été mise au point avec succès pour obtenir les génomes complets de virus à simple brin ADN circulaire. Un article scientifique a été publié sur la base de ces nouveaux protocoles. Cette approche est par ailleurs maintenant utilisée chez trois partenaires du projet.
• Mise au point avec succès du séquençage Nanopore de produits d’amplification issus de semi-purifications des acides nucléiques viraux (technique VANA)


• L’approche de metabarcoding botanique basée sur trois marqueurs (ITS, trnL-g et trnL-c) s’est avérée performante pour identifier les communautés de plantes récoltées en France.

Ces avancées méthodologiques sont encourageantes et devraient permettre de traiter l’ensemble des échantillons collectés afin de répondre à l’objectif général du WP1.

WP1: Measuring and mapping the phytoviral species richness of ecosystems: testing whether plant species richness influences phytovirus species richness

• Collectes de plantes
Plusieurs campagnes de collectes de plantes ont été réalisées en 2020-2021 en dépit de la survenue de la pandémie de COVID19, en voici la liste détaillée task par task :
• Task1.1: Phytovirus species richness of uncultivated plants within natural ecosystems
- Bordeaux (5 grilles), Camargue (5 grilles), Réunion (5 grilles) en 2020
- Bordeaux (5 grilles), Angers (5 grilles), Camargue (5 grilles) et Réunion (5 grilles) en 2021
- Togo (5 grilles) en 2021
Il est à noter que nous avons pu profiter de la présence d’un Post-Doc togolais (Essowè Palanga) au sein de l’UMR PHIM en 2021 pour organiser et réaliser une campagne d’échantillonnage au Togo. Les campagnes d’échantillonnages prévues à Angers (2020), en Arizona (2020 et 2021) et en Afrique du Sud (2020 et 2021) n’ont en revanche pas été effectuées en raison de la pandémie. Ces collectes sont donc reportées à 2022 et 2023.

• Task1.2: Phytovirus species richness at the interfaces between managed cultivated ecosystems and unmanaged natural ecosystems
- 4 grilles sur parcelles à l’interface zone cultivée / zone naturelle en Camargue en 2021
- 4 grilles parcelles agricoles en Camargue en 2021

• Task 1.3: Phytovirus species richness within invasive exotic plants
Deux protocoles d’échantillonnage ont été élaborés pour répondre à l’objectif du task 1.3.
• Protocole « station-centrée » : sur un site de collecte, les plantes exotiques ainsi que leurs congénères indigènes sont prélevés à raison de 50 plants par espèce botanique. Ce protocole a été suivi à la Réunion en 2020 et en 2021 ainsi qu’en Camargue en 2021.
Protocole « plante-centrée » : deux plantes exotiques envahissantes en France ont été sélectionnées (Bothriochloa barbinodis et Senecio inaequidens) comme modèles d’étude. Ces deux plantes, ainsi que les espèces indigènes de la même famille, ont été récoltées sur plusieurs sites en France (Bordeaux, Angers, côte Méditerranéenne) en 2021. Toujours en 2021, des populations de ces deux plantes ont aussi été collectées dans leurs centres d’origines respectifs (i.e l’Arizona pour Bothriochloa barbinodis et l’Afrique du Sud pour Senecio inaequidens).

WP2: Studying the effect of plant community features on viral species richness
Les campagnes de collectes se sont déroulées comme prévu dans le projet initial. Cinq collectes ont été réalisées à ce jour (juin 2020, novembre 2020, mars 2021, juin 2021 et novembre 2021), pour un total de 480 échantillons récoltés. Le protocole VANA de métagénomique virale a été appliqué à partir de ces échantillons et un run de séquençage Illumina a été réalisé en 2021 à partir de 288 échantillons. Les séquences sont en cours d’analyse.
L’avancement des travaux de ce WP est conforme au plan initial.

Les retards observés pour l’ensemble des tâches résultent de la survenue de la pandémie COVID19 et des restrictions sanitaires qui ont prévalues en 2020 et 2021 (confinements, difficulté à réaliser des missions de terrain, fermeture des frontières etc.). Cet enchaînement de difficultés nous a poussé à demander un report d’un an de la fin du projet (fin février 2025), demande qui a été acceptée par l’ANR.

Le task 2.2 (“Effects of plant community composition, species richness, plant biomass and population density on the species richness of phytoviruses of an exotic invasive plant”) ne pourra pas être réalisé car les graines de Bothriochloa barbinodis semées au sein des différentes communautés végétales installées sur la parcelle de la Tour du Valat en Camargue n’ont pas germé. Une deuxième campagne de semis a été réalisée en février 2020, et à nouveau aucune graine n’a germé. Ce task a donc été abandonné. Toutefois, Bothriochloa barbinodis a été choisie comme l’un des deux modèles d’étude (Task 1.3) cherchant à comparer le virome de plantes invasives exotiques envahissantes avec les viromes des plantes indigènes botaniquement proches.

Mis à part le problème (probablement non résolu) de la pandémie du COVID19, le calendrier et le budget sont maîtrisés (grâce notamment à l’acceptation d’un report d’un an de la clôture du projet par l’ANR). Les partenaires collaborent conformément aux attentes et au planning établi. Les rapports entre partenaires sont très bons et très constructifs.

Deux protocoles utilisant l’approche de séquençage Nanopore pour obtenir les génomes complets de geminivirus ont été mis au point dans les laboratoires de la Réunion et de Montpellier. Ce résultat marquant a fait l’objet d’une publication dans le journal Microorganisms

Les maladies émergentes des plantes, causées en grande partie par les phytovirus, pèsent lourdement sur la sécurité alimentaire et sur la stabilité économique des sociétés. Cependant, aucune étude n'a fourni à ce jour une vue complète de la répartition géographique de la diversité des phytovirus, incluant à la fois le nombre des espèces de phytovirus (richesse spécifique) et l’équitabilité de leur distribution dans n'importe quel environnement sur Terre. Ce manque de connaissances compromet notre compréhension générale de l'adaptation des phytovirus et de facto du fonctionnement global des écosystèmes et limite par ailleurs notre capacité à élaborer des modèles prédictifs véritablement généraux d'émergence des phytovirus.

Une nouvelle génération de travaux de métagénomique a récemment émergé en pathologie des plantes, permettant non seulement d’analyser le virome global d’une plante mais aussi de relier directement les séquences des phytovirus à leur hôte et à une position géographique. Ces travaux de métagénomique spatiale ont révolutionné notre vision à l’échelle des écosystèmes de la fréquence d’infection des plantes sauvages et cultivées par des phytovirus. Ces études ont ainsi révélé que les infections virales sont significativement plus fréquentes en zones cultivées qu'en zones naturelles, suggérant que le regroupement et la concentration d'organismes génétiquement proches favorisent les épidémies. Ces études pionnières n’ont cependant pas permis de fournir une vue complète de la répartition géographique de la diversité des espèces des phytovirus. Nous proposons dans ce projet d’élargir les conclusions de ces travaux récents de métagénomique spatiale en testant les deux hypothèses suivantes :

- La structure de la communauté des plantes influence la structure de la communauté phytovirale : nous testerons si la richesse spécifique, la composition, la densité et la biomasse des espèces de la communauté végétale peuvent être des prédicteurs de la richesse spécifique phytovirale.

- Le taux d'évolution moléculaire des virus est plus lent dans les zones non cultivées que dans les zones cultivées : nous testerons si l’agriculture est susceptible de sélectionner des virus à multiplication rapide, à transmission précoce et à forte virulence.

Le projet PHYTOVIRUS a trois objectifs scientifiques : (i) tester si la richesse spécifique botanique influence la richesse spécifique phytovirale dans les zones naturelles et cultivées, (ii) étudier expérimentalement l’effet de plusieurs paramètres des communautés de plantes sur la richesse spécifique phytovirale et (iii) analyser les traces évolutives présentes au sein des génomes des phytovirus identifiés. Le premier work package (WP1) sera axé sur l’inventaire par métagénomique virale des phytovirus présents au sein d’écosystèmes naturels et cultivés pilotes et sur la comparaison des richesses spécifiques phytovirale et botanique. Le WP2 testera expérimentalement s'il existe des associations entre la richesse en espèces des phytovirus et plusieurs paramètres des communautés végétales (richesse, densité, composition et biomasse). Enfin, le WP3 explorera les données de séquence générées dans les WP1/2 pour détecter et caractériser les empreintes évolutives (taux de substitutions, recombinaison, sélection naturelle) des phytovirus identifiés.

Le projet regroupe des scientifiques reconnus en virologie végétale, métagénomique virale, écologie végétale, statistiques et bioinformatique. Ce consortium multidisciplinaire a la capacité de mettre en œuvre un programme de recherche sans équivalent au niveau international concernant la caractérisation de la richesse spécifique des phytovirus des écosystèmes et des paramètres évolutifs l’ayant façonné. Ce projet vise également à mettre au point et valider une approche expérimentale standardisée permettant de mesurer la richesse spécifique des phytovirus qui pourrait ensuite être utilisée universellement à différentes échelles géographiques.