Le croisement intersystème dans les protéines fluorescentes: un nouveau mécanisme pour la microscopie de fluorescence confocale à contraste dynamique – dISCern

Les processus de croisement intersystème dans les PF, ainsi que les étapes thermiques de photocommutation des PFPC, seront étudiés sur le plan fondamental par une combinaison originale d’approches expérimentales utilisant une illumination soit continue, soit pulsée pour induire la photochimie. Nous réaliserons des mesures de spectroscopie résolue en temps de type pompe-sonde et pompe-pompe-sonde aux échelles ns-µs-ms sur des protéines sélectionnées, afin de caractériser leurs mécanismes en détail (y compris la fluorescence et la photoréactivité d’espèces de durée de vie courte). Les effets d’environnement seront étudiés en déterminant les paramètres photodynamiques (section efficace et durée de vie de triplet, temps caractéristiques de photocommutation à haute intensité, etc.) de séries de PF et de PFPC, grâce à un montage optique automatisé fournissant une illumination continue d’intensité variable jusqu’à ~100 kW.cm-2. Nous exploiterons ensuite l’ajustabilité des paramètres de balayage d’un microscope confocal commercial pour concevoir théoriquement, puis mettre en œuvre des protocoles d’imagerie permettant de distinguer plusieurs PF ou PFPC grâce à leur dynamique de triplet ou de photocommutation.

Sera renseigné en fin de projet.

Sera renseigné en fin de projet.

« Dynamic contrast with reversibly photoswitchable fluorescent labels for imaging living cells », R. Chouket, A. Pellissier-Tanon, A. Lemarchand, A. Espagne, T. Le Saux, L. Jullien, Chem. Sci. 2020, 11, 2882-2887, DOI: 10.1039/D0SC00182A
« Dynamic contrast for overcoming spectral interferences in fluorescence imaging », R. Chouket, R. Zhang, A. Pellissier-Tanon, A. Lemarchand, A. Espagne, T. Le Saux, L. Jullien, J. Phys.: Photonics 2020, 2, 032003, DOI: 10.1088/2515-7647/ab9099

Outils omniprésents en imagerie biologique, les protéines fluorescentes (PF) de la famille de la GFP présentent une variété de réactions photochimiques dont les mécanismes ne sont encore que partiellement compris. Certaines de ces réactions ont conduit à des applications innovantes. Les méthodes d’imagerie à contraste dynamique exploitent ainsi la dynamique de transition de protéines fluorescentes photocommutables (PFPC) entre leurs états ON et OFF pour les imager sélectivement en présence d’espèces spectralement similaires, photocommutables ou non.
Notre consortium de photochimistes, de spectroscopistes et de théoriciens se propose d’examiner deux aspects encore méconnus de la photochimie des PF présentant un intérêt élevé pour l’imagerie à contraste dynamique :
- la formation, la photoréactivité et la dynamique des états triplets ;
- la nature et les cinétiques des étapes de photocommutation µs-ms des PFPC.
Nos objectifs sont plus précisément :
1) de caractériser sur un plan fondamental les mécanismes et la dynamique de ces réactions ainsi que leur sensibilité à l’environnement protéique dans différentes PF ;
2) de développer de nouveaux protocoles d’imagerie de fluorescence confocale à contraste dynamique exploitant ces réactions.
Le projet s’appuie sur des travaux récents (auxquels a contribué le partenaire 2) indiquant que les PF standard, considérées auparavant comme non-photocommutables, peuvent en fait être photocommutées de manière réversible entre leurs états singulet et triplet. Ces propriétés de photocommutation font des PF standard des sondes très prometteuses pour l’imagerie à contraste dynamique, en complément des PFPC. Du fait de leurs rendements faibles (~1%) et de leurs durées de vie courtes (ms), la formation des états triplets de PF nécessite des densités d’illumination élevées, qui peuvent être réalisées en microscopie confocale à balayage (10-100 kW.cm-2). Dans ces conditions d’illumination, la dynamique de photocommutation des PFPC est limitée par la cinétique d’étapes thermiques (échelle µs-ms).
Les processus de croisement intersystème dans les PF, ainsi que les étapes thermiques de photocommutation des PFPC, seront étudiés sur le plan fondamental par une combinaison originale d’approches expérimentales utilisant une illumination soit continue, soit pulsée pour induire la photochimie. Le partenaire 2 réalisera des mesures de spectroscopie résolue en temps de type pompe-sonde et pompe-pompe-sonde aux échelles ns-µs-ms sur des protéines sélectionnées, afin de caractériser leurs mécanismes en détail (y compris la fluorescence et la photoréactivité d’espèces de durée de vie courte). Les effets d’environnement seront étudiés en déterminant les paramètres photodynamiques (section efficace et durée de vie de triplet, temps caractéristiques de photocommutation à haute intensité, etc.) de séries de PF et de PFPC, grâce à un montage optique automatisé récemment développé par le partenaire 1 et fournissant une illumination continue d’intensité variable jusqu’à ~100 kW.cm-2. Les partenaires 1 et 3 exploiteront ensuite l’ajustabilité des paramètres de balayage d’un microscope confocal commercial pour concevoir théoriquement, puis mettre en œuvre des protocoles d’imagerie permettant de distinguer plusieurs PF ou PFPC grâce à leur dynamique de triplet ou de photocommutation.
Notre projet fera progresser la connaissance de la photochimie des PF et des PFPC. Ces avancées fondamentales devraient avoir un impact dans le domaine de l’imagerie de fluorescence en général. On peut en effet supposer que l’accumulation d’états triplets de PF conduit à des signaux de fluorescence réduits dans un grand nombre d’expériences d’imagerie. Le projet devrait en outre élargir de manière significative la portée de l’imagerie à contraste dynamique en l’ouvrant à de nouveaux fluorophores, de nouveaux paramètres de discrimination et de nouveaux modes d’imagerie.